リポ多糖誘発性炎症性滲出液コレクションのためのエアポーチマウスモデル

要約

出典:Lu、Q.、他 マウスの好中球の移動と浸潤の検出。J. Vis. Exp.(2020年)。

この動画では、マウスの皮下組織にエアパウチを生成し、in vivoでのリポ多糖投与に応答して炎症性滲出液を収集する手順を説明しています。このビデオでは、エアパウチ内の好中球浸潤の分析についても説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. エアパウチアッセイ

1. 最初のエアインジェクション
   1. 0日目に、マウスに5%イソフルランを5%イソフルランで3分間、ガス麻酔チャンバーで2 L / minの速度で完全に麻酔し、各マウスの麻酔を2%イソフルランで1つの呼吸ユニットで0.5 L / minの速度で維持します><。 手記：マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前に、つま先をつまむことにより、十分な麻酔の深さが確保されます。つま先が挟まれているときは、足が動かないようにする必要があります。
   2. 5 mLシリンジに取り付けた0.22 μmフィルターを使用して、3 mLの滅菌空気を採取します。
   3. 麻酔をかけたマウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、26G x 3/8インチの針を使用して3mLの滅菌空気を皮下注射します。
   4. 治療後、マウスを呼吸ユニットから取り外します。マウスを監視して、動き始めるまでマウスが生きていることを確認します。
2. 2回目のエアインジェクション
   1. 3日目に、セクション1.1で説明されているように、以前に設置されたエアポケットに追加の3mLの滅菌空気を注入して、エアポーチを維持します。
3. 処遇
   1. 6日目、犠牲の6時間前に、エアポーチにさまざまな治療を注入します。ネガティブコントロールとして1mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注入します。1 mLの1 μg/mL LPSをポジティブコントロールとして注入し、局所炎症を誘発します。
   2. マウスに5%イソフルランを5%イソフルランで3分間、ガス麻酔チャンバー内で2 L/minの速度で完全に麻酔し、各マウスの麻酔を1つの呼吸ユニットで2%イソフルランを0.5 L/minの速度で維持します。材料の表に従って洗浄バッファーを調製します
      手記： マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前に、つま先をつまむことにより、十分な麻酔の深さが確保されます。つま先が挟まれているときは、足が動かないようにする必要があります。
   3. 各エアポーチについて、エアポーチを1 mLの洗浄バッファーで洗浄し、炎症性滲出液を15 mLの遠心分離チューブに集めます。.エアポーチを2mLの洗浄バッファーで2回洗浄し、炎症性滲出液を同じ遠心チューブに集めます。
   4. 100 x gで10分間RTで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を1 mLの洗浄バッファーに再懸濁します。細胞を数え、自動血液分析装置を使用して好中球比を定量化します.
      手記： 図 1 の代表的な結果を参照してください。

結果

図1:エアパウチアッセイの代表的な結果。(A)エアポーチアッセイの図。(B)エアパウチアッセイにおける白血球サブセット浸潤の代表的な結果。PBS:コントロール;LPS:1μg/mL LPS。データは SD ±平均として表示されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100%エタノール	北京化学工場
メタノール100%	北京化学工場
15 mLコニカルポリプロピレン遠心チューブ	隼	隼
23 G x 1 1/4 "針	BDの	305120
26 G x 3/8インチ針	BDの	305110
30 G x 1/2 "ニードル	BDの	305106
5 mLシリンジ	BDの	Z683574
50 mLコニカルポリプロピレン遠心分離チューブ	隼	14-432-22
ガス麻酔システム	ZSディチュアン	ZS-MV-IV
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1×			90% ddH2O と 10% (v/v) 10×PBS を混合、オートクレーブ滅菌
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10×			NaCl 16 g、KCl 0.4 g、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4 (無水) 0.48 g を 200 mL ddH2O に溶解し、pH 7.4 に調整し、オートクレーブ滅菌します
リポ多糖類(LPS)	シグマ	L3012
エアパウチアッセイにおける洗浄バッファー			0.5M EDTAをHBSSで10mMに希釈

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