方法論記事

感染マウス胃におけるヘリコバクター・ピロリ負荷の定量化

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典: D'Costa, K. et al., Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathology. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、感染後のマウス胃組織におけるヘリコバクター・ピロリの負荷を定量化し、そのコロニー形成を確認するためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 感染後の胃の細菌の定着の確認

  1. 胃の中でのピロリ菌の生存可能なカウント
    1. 滅菌HBAプレートに追加の抗生物質(200 μg/mLバシトラシンおよび10 μg/mLナリジクス酸)を補充してから、感染したマウスの胃からコロニーカウントを行います。
    2. 胃の切片は、オートクレーブ可能なポリプロピレン製マイクロ乳棒を使用して手動で、または機械的な解離装置を使用して均質化します(材料の表を参照)。
    3. 得られた胃ホモジネートの重複した段階希釈液(10-1〜10-2)を滅菌BHI.
      で調製します 手記：希釈は、感染に使用された特定のピロリ菌株について得られる典型的な細菌負荷と、感染期間に基づいて決定する必要があります。原液サンプルも使用できます。
    4. 予備乾燥したHBAプレート(注:単一コロニーの分離を確実にするために、HBAプレートは使用前に生物学的安全キャビネットまたは37°Cインキュベーターで10〜15分間温めて乾燥させる必要があります)を3つまたは4つのセグメントに分割します。Miles and Misra法を応用して、各希釈液を10〜100 mLを寒天プレートの一部に加え、滅菌プラスチックループを使用して広げます。
    5. プレートを乾かしてから、逆さの位置(蓋を下にして)に嫌気性ガス瓶に入れます。瓶内の湿度を維持するために、水が入ったシャーレを含めます。
    6. コロニーが形成されるまで(通常は4〜7日)37°Cでジャーをインキュベー
      7. トします。
    7. 10から100の分離されたコロニーを含むセグメントを列挙します。
      注:H.ピロリ菌のコロニーとH.felisのプレート上の成長は、標準的なウレアーゼ、カタラーゼ、およびオキシダーゼ試験を使用して、マウスの胃内細菌叢の他のメンバーのものと区別できます。H. pylori と H. felis は 3 つのテストすべてで陽性です。
    8. 次の式を使用して、細菌負荷を(CFU / gの組織)として計算します:
      [(カウントされた平均コロニー数)×(希釈係数)×(メッキされた体積)]/(胃の重量)。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細菌学的試薬
オキソイド血液寒天培地 No.2サーモフィッシャーサイエンティフィックCM0271B滅菌前に脱イオン水に溶解してください
プレミアム除細動馬の血オーストラリアの倫理的生物製剤PDHB100
バクトブレインハートインフュージョンブロスBDバイオサイエンス237500滅菌前に脱イオン水に溶解してください
CampyGen ガスパックサーモフィッシャーサイエンティフィックCN0025A CN0035A
抗生物質
バンコマイシンシグマ・アルドリッチV2002-1Gの脱イオン水に溶解します
ポリミキシンBシグマ・アルドリッチP4932-5MU脱イオン水に溶解します
トリメトプリム(≥98%HPLC)シグマ・アルドリッチT7883100%(絶対)エタノールに溶解
アムホテリシンアムレスコ(アストラルサイエンティフィック)E437-100MG脱イオン水に溶解します
Bacillus licheniformis由来のバシトラシンシグマ・アルドリッチB0125脱イオン水に溶解します
ナラジクス酸シグマ・アルドリッチN8878脱イオン水に溶解します
機器とプラスチック製品
オキソイド嫌気性ジャーサーモフィッシャーサイエンティフィックHP0011/HP0031
COPANパスツールピペットインターパスサービス200CS01
エッペンドルフ5810R遠心分離機バクテリアペレットを2,200rpmで遠心分離し、4°Cで10分間回収
パラフィルムMベミス、VWRPM996
Eppendorf micropetle for 1.2 - 2 mL tubes(エッペンドルフマイクロペストル 1.2 - 2 mLチューブ用)シグマ・アルドリッチZ317314胃の均質化に使用されるオートクレーブ可能なポリプロピレン乳棒
GentleMACsディスソシエータミルテニーバイオテック〒130-093-235マウスの胃組織のための事前設定されたgentleMACSプログラムを使用してください
Mチューブ(オレンジキャップ)ミルテニーバイオテック〒30093-236
Qubitフルオロメーターサーモフィッシャーサイエンティフィック質問33216
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