雄マウスにおける尿路感染症モデルを生成するための経尿道的カテーテル法と細菌接種

要約

出典:Zychlinsky Scharff, A., et al. 小動物モデルにおける尿路感染症:雄および雌マウスの経尿道的カテーテル法。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、経尿道的カテーテル点眼による雌マウスの膀胱における尿路病原性大腸菌感染の確立を示しています。注入された細菌は、膀胱内の尿路感染症を確立することに成功し、尿路に関連する医療関連疾患の研究に貴重なプラットフォームを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. カテーテルの準備

1. 感染するマウスのグループごとに1つの小児用静脈内アクセスカニューレを準備します。内蔵のスプリングメカニズムを使用して、製造元の指示に従って、各カニューレの針を離します。針を廃棄し、プラスチック製の静脈内カニューレのみを保存します。
2. 層流フード内のカテーテルを1回の紫外線(U.V.)サイクル、通常は25〜30分
   で滅菌します 注:カテーテルは複数のマウスに使用できますが、実験グループ、性別、または細菌株間で新しいカテーテルを使用する必要があります。

2. 尿路病原性大腸菌の感染用調製

1. 感染の少なくとも2日前に、滅菌接種ループを使用して、凍結細菌ストックからUPECをLuria Broth(LB)寒天プレートにストリークし、必要に応じて抗生物質を含有します。37°Cで一晩インキュベートします。プレートは4°Cで最大1週間保存できます。
2. 100 mLの滅菌三角フラスコに、必要に応じて抗生物質を含む10 mLのLBにLBプレートの1つのコロニーを接種し、37°Cで一晩(約16〜18時間)インキュベートします
   注:スタンディングカルチャーは、感染に必要な1型線毛の発現を可能にします。振とうして育った培養物は、線毛の発現効率が低くなり、したがって感染率が一定しなくなります。
3. 一晩培養の光学密度(OD)₆₀₀を測定し、事前に決定された成長曲線を使用してmlあたりの細菌数を計算します。例として、UPEC株UTI89の場合、OD₆₀₀ = 0.35は2 x 10⁸ CFU / mlに相当し、したがって、OD₆₀₀ = 2.4の一晩培養は13.7 x 10⁸ CFU / mlに相当します。OD₆₀₀と生存細菌との関係を、感染に使用されるすべての新しい株で経験的に決定します。
4. 感染する動物の数と、各マウスが50μlのPBS中に約10個の⁷コロニー形成単位(CFU)を投与する必要があることを考慮して、必要な細菌の量を決定します。計算には、カテーテルとシリンジのナブの ~130 μl のデッドボリュームと、接種物を決定するために必要な 100 μl を含めます。
   1. 細菌懸濁液を卓上微量遠心分離機で17,000 x gで1分間回転させ、得られた細菌ペレットをPBSで1 mlあたり2 x 10⁸ CFUで再懸濁します。この懸濁液のアリコートを連続希釈し、必要に応じて抗生物質を使用してLB寒天にプレートし、各感染の正確な接種量を決定します。
5. 細菌の接種物を1mlのシリンジに引き込み、カテーテルをシリンジの端に取り付けます。シリンジを軽くたたいて空気を取り除き、注入を開始する前にプランジャーを押し下げてカテーテルのデッドエアスペースを埋めます。

3. マウスの準備

1. 100 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンの腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。.補助的な熱を提供することができます。
2. フットパッドを中程度の圧力で握り、各マウスが完全に鎮静されていることを確認します。マウスは反応しない場合、完全に鎮静され、この状態に達するまでに3〜5分かかります。
3. マウスを仰臥位に置き、下腹部に中程度の圧力を加えて膀胱の尿を空にします。.満杯の膀胱は、腸骨稜の間の皮膚の下でエンドウ豆のように感じます.
   注:吸入イソフルランは雌マウスのカテーテル挿入に使用されてきましたが、この手順で雄マウスが吸入イソフルランによって十分に麻酔されているかどうかはテストされていません。.

4. 雄マウスの経尿道的点滴

1. 2つの親指鉗子をマウスの外性器に対して頭蓋と尾側に置きます。包皮を引っ込めて、陰茎亀頭を完全に露出させます。陰茎が外部に配置されたら、親指鉗子を放します。
2. 鉗子の位置を変えて、突き出た陰茎を動物に対して垂直に安定させ、臓器を優しく、しかしぴんと張って保持します。尿道口を視覚化し、臓器の先端にある小さな開口部にカテーテルを慎重に挿入します。カテーテルを陰茎に優しく導き、マウスの体に向かって、鉗子との穏やかな張力を維持します。カテーテルは潤滑を必要としません。カテーテルを陰茎に無理に押し込まないでください。カテーテルは尿道にスムーズに滑り込み、正しい配置を示します。
3. カテーテルのハブが陰茎の先端に接触したら、陰茎の位置を維持しながら、50μlの接種物を非常にゆっくりと分注します。このとき、点滴の品質は、図1に示すような所定の点滴品質スコアに従って記録することができる。
4. 接種物の漏れを防ぐために、カテーテルを5回以上ゆっくりと引っ込めます。マウスを仰臥位でケージに入れます。動物は麻酔薬の投与後30〜45分で回復し始めるべきです。

結果

図1:点眼の質は、感染後24時間での細菌負荷と相関していません。 6〜8週齢の雌と雄のC57Bl/6マウスに10⁷ CFUのUPECを注入しました。各点眼の直後に、1人の研究者が、特定の基準(枠付きテキスト)で定義された品質スコアを点眼に割り当てました。感染後24時間後に、細菌負荷を列挙するために膀胱を無菌的に除去しました。プロットは、割り当てられた品質スコアとCFU/ブラダーを示しています。各ドットは1匹のマウスで、5つのプールされた実験が示されています。p = 0.17、Kruskal-Wallis検定は、各列の平均ランクを他のすべての列の平均ランクと比較し、多重比較のための事後ダン検定を使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD Insyte Autoguard シールド IV カテーテル 24 G、外径 0.7 mm、長さ 14 mM	BDメディカル	381811または381411*	*カタログ番号は国によって異なります
接種ループ	グライナーバイオワン	731171
注射 器	B ブラウン	9166017V
親指(Adson)鉗子	ファインサイエンスツール	11006から12
インスリン用シリンジ	テルモ	BS05M2913
5 mlチューブ、ポリプロピレン	隼	352063
LBミラーブロス	ディフコ	244620
LBミラー寒天培	ディフコ	244520
キュヴェット	バイオ・ラッド	〒223-9955