雌マウスにおける尿路感染症モデルの確立

要約

出典:Zychlinsky Scharff, A. et al., 小動物モデルにおける尿路感染症:オスとメスのマウスの経尿道的カテーテル法。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、経尿道的カテーテル点眼による雌マウスの膀胱における尿路病原性大腸菌感染の確立を示しています。注入された細菌は、膀胱内の尿路感染症を確立することに成功し、尿路に関連する医療関連疾患の研究に貴重なプラットフォームを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. カテーテルの準備

1. 感染するマウスのグループごとに1つの小児用静脈内アクセスカニューレを準備します。内蔵のスプリングメカニズムを使用して、製造元の指示に従って、各カニューレの針を離します。針を廃棄し、プラスチック製の静脈内カニューレのみを保存します。
2. 層流フード内のカテーテルを1回の紫外線(U.V.)サイクル、通常は25〜30分
   で滅菌します 手記：カテーテルは複数のマウスに使用できますが、実験グループ、性別、または細菌株間で新しいカテーテルを使用する必要があります。

2. 尿路病原性大腸菌の感染症用調製

1. 感染の少なくとも 2 日前に、滅菌接種ループを使用して、凍結細菌ストックから尿路病原性大腸菌 (UPEC) を Luria Broth (LB) 寒天プレートにストリークします。37°Cで一晩インキュベートします。プレートは4°Cで最大1週間保存できます。
2. 100 mLの滅菌三角フラスコに、必要に応じて抗生物質を含む10 mLのLBにLBプレートの1つのコロニーを接種し、37°Cで一晩(約16〜18時間)インキュベートします
   手記：スタンディングカルチャーは、感染に必要な1型線毛の発現を可能にします。振とうして育った培養物は、線毛の発現効率が低くなり、したがって感染率が一定しなくなります。
3. 一晩培養の光学密度(OD)₆₀₀を測定し、事前に決定された成長曲線を使用してmlあたりの細菌数を計算します。一例として、UPEC株UTI89の場合、OD₆₀₀ = 0.35は1 mlあたり2 x 10⁸コロニー形成単位(CFU)に相当し、したがって、OD₆₀₀ = 2.4の一晩培養は13.7 x 10⁸ CFU /mlに相当します。OD₆₀₀と生存細菌との関係を、感染に使用されるすべての新しい株で経験的に決定します。
4. 感染する動物の数を考慮し、各マウスが50 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に約10⁷コロニー形成単位(CFU)を投与する必要があることを考慮して、必要な細菌の数を決定します。計算には、カテーテルとシリンジのナブの ~130 μl のデッドボリュームと、接種物を決定するために必要な 100 μl を含めます。
   1. 細菌懸濁液を卓上微量遠心分離機で17,000 x gで1分間回転させ、得られた細菌ペレットをPBSで1 mlあたり2 x 10⁸ CFUで再懸濁します。この懸濁液のアリコートを連続希釈し、必要に応じて抗生物質を使用してLB寒天にプレートし、各感染の正確な接種量を決定します。
5. 細菌の接種物を1mlのシリンジに引き込み、カテーテルをシリンジの端に取り付けます。シリンジを軽くたたいて空気を取り除き、注入を開始する前にプランジャーを押し下げてカテーテルのデッドエアスペースを埋めます。

3. マウスの準備

1. 100 mg / kgケタミンと5 mg / kgキシラジンの腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。.補助的な熱を提供することができます。
2. フットパッドを中程度の圧力で握り、各マウスが完全に鎮静されていることを確認します。マウスは反応しない場合、完全に鎮静され、この状態に達するまでに3〜5分かかります。
3. マウスを仰臥位に置き、下腹部に中程度の圧力を加えて膀胱の尿を空にします。.満杯の膀胱は、腸骨稜の間の皮膚の下でエンドウ豆のように感じます.
   手記：吸入イソフルランは雌マウスのカテーテル挿入に使用されてきましたが、この手順で雄マウスが吸入イソフルランによって十分に麻酔されているかどうかはテストされていません。

>4. 雌マウスの経尿道的点滴

1. 利き手ではない方の手を使って、親指を尻尾に置き、同じ手の指をマウスの腹部に置き、反対方向に優しく圧力をかけてマウスをしっかりと固定します。
2. カテーテルの先端をマウスに対して垂直に尿道口に置きます。.穏やかな圧力で、ハブが尿道開口部に接するまでカテーテルを尿道にスライドさせ、同時にシリンジを下げて作業面と平行になるようにします。カテーテルは潤滑を必要としません。カテーテルを尿道に押し込んだり、無理に押し込んだりしないでください。カテーテルは、抵抗がほとんどまたはまったくなく、スムーズかつ簡単に尿道に滑り込む必要があります。
   1. 接種物を点眼する前に(ステップ4.3)、カテーテルが所定の位置に配置されたら、マウスの腹部にすでにある非利き手から指で腹部の皮膚をマウスの頭に向かって非常に穏やかに引っ張ります(ステップ4.1)。カテーテルが尿道内にある場合、尿道開口部を構成する組織は移動しませんが、カテーテルが誤って膣に配置されると、組織は上に移動してカテーテルから離れます。この迅速検査は、各マウスで実行する必要があります。
3. カテーテルのハブが尿道開口部に接したら、50 μlの細菌接種物をゆっくりと分注します。点滴速度が遅いと、腎臓への膀胱尿管逆流が最小限に抑えられます。漏れを防ぐために、カテーテルをゆっくりと取り外します(5カウント以上)。マウスを仰臥位でケージに入れます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BD Insyte Autoguard シールド IV カテーテル 24G、外径 0.7 mm、長さ 14 mM	BDメディカル	381811または381411*	*カタログ番号は国によって異なります
接種ループ	グライナーバイオワン	731171
LBミラーブロス	ディフコ	244620
LBミラー寒天培	ディフコ	244520
キュヴェット	バイオ・ラッド	〒223-9955
注射 器	B ブラウン	9166017V
インスリン注射器	テルモ	BS05M2913

地