フローサイトメトリーを用いた尿路病原性大腸菌感染マウス膀胱組織における免疫細胞浸潤の定量化

要約

出典: Zychlinsky Scharff, A. et al., 小動物モデルにおける尿路感染症:経尿道的マウスのオスとメスのカテーテル法。(2017年)

このビデオでは、大腸菌に感染したマウス膀胱のCD45⁺免疫細胞を定量化し、免疫細胞の浸潤を測定するフローサイトメトリーベースの手法を実演しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 膀胱組織のフローサイトメトリー解析

1. コラゲナーゼを34ユニット/mLで、DNaseを100 μg/mLでPBS中に含有する消化バッファーを調製します。氷の上を保ってください。分析する動物1匹につき15mlのコニカルチューブを1本用意し、チューブ1本につき1mlの消化緩衝液を分注します。
2. 所定の時点で、承認された標準操作手順(例:子宮頸部脱臼または二酸化炭素の過剰摂取)を使用してマウスを犠牲にします。毛皮による汚染を最小限に抑えるために、70%エタノールで腹部を完全に湿らせます。
3. はさみを使用してマウスの腹部の下3分の1を少なくとも2cm切開し、膀胱全体を取り除きます。はさみでよくミンチし、膀胱を2〜3 mmの²サイズ、通常は約8個に切ります。
   1. 消化バッファーを含むチューブごとに1つのみじん切り膀胱を追加します。.振ってみじん切りにした膀胱組織を消化緩衝液に洗い流します。すべての膀胱が解剖され、ミンチになるまで氷の上に置いてください。
4. みじん切りにした膀胱を37°Cで60〜75分間インキュベートし、15分ごとに手で5秒間激しく振とうします。ティッシュが濡れたティッシュペーパーに似たガラスのような透明な外観になったら、消化が完了します。消化が長引くと、同定に必要な細胞から表面タンパク質が除去されるため、避けるべきです。
5. 2〜3 mLの氷冷フローサイトメトリーバッファー(2%ウシ胎児血清(FBS)と0.2 mM EDTAを含むPBS)を加えて消化酵素を不活性化し、穏やかに混合します。チューブを氷の上に置きます。
6. シングルセル懸濁液を確保し、結合組織を除去するには、チューブの内容物を15 mLのコニカルチューブに入れた100 μmフィルターに通します。シリンジプランジャーの端で、残っている組織をフィルターにそっと押し込みます。.フィルターを2 mLのフローサイトメトリーバッファーで洗浄します。サンプルを氷の上に置きます。
7. 200 x g、4 °Cで7分間遠心分離してサンプルを洗浄し、ペレットをFcブロックを含む100 μLフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、5 μg/mLに希釈し、96ウェル丸底プレートに移します。10〜15分後、各サンプルに100 μLの希望の抗体カクテルを加えます。サンプルを氷上で30〜45分間インキュベートし、光から保護します.
   手記：Fcブロックは、抗体のFc部分がFc受容体を発現する細胞に結合するのを防ぐために使用される試薬です。その目的は、非特異的抗体の結合を最小限に抑えることです。使用する抗体の決定は、実験で検証される仮説に依存し、文献からの入力に基づいて選択する必要があります。図1では、免疫細胞全体の浸潤を測定するために、汎免疫細胞タンパク質である抗CD45抗体を使用しました。
8. 200 x g、4 °Cで7分間遠心分離してサンプルを洗浄し、細胞ペレットを200 μLのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、サンプルを5 mLのポリスチレンチューブに
通してサンプルをフローサイトメーターで取得します。
9. フローサイトメーターでサンプル全体を採取します。良好な消化は200,000〜400,000個の細胞を産出し、ナイーブマウスの膀胱からは8,000〜10,000個のCD45⁺免疫細胞を産出しますが、感染した臓器にはより多くの細胞が含まれます(図1).
   手記： フローサイトメトリー解析用に調製されたサンプルは、CFUの評価には使用できません。尿路病原性大腸菌(UPEC)のコロニー形成または免疫細胞の浸潤が組織全体で均一であることを示す証拠は存在しないため、膀胱を2つの部分に分割することは推奨されません。

結果

図1:UTIに応答して雌マウスの免疫細胞浸潤が増加する。生後6週齢から8週齢の雌と雄のC57Bl/6マウスに、10⁷ CFUのUPECを注入した。代表的なドットプロットは、ナイーブマウスまたは感染マウスのCD45⁺免疫細胞をピンク色にゲートした全膀胱細胞を示しています。このグラフは、ナイーブマウスまたは24時間感染マウスの膀胱内のCD45⁺免疫細胞の絶対数を示しています。各ドットは1匹のマウスで、2つのプールされた実験が示されています。p値はマンホイットニー検定によって決定されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
注射 器	B ブラウン	9166017V
親指(Adson)鉗子	ファインサイエンスツール	11006から12
5 mLチューブ、ポリプロピレン	隼	352063
ティッシュラプターディスポーザブルプローブ	キアゲン	990890
15 mLフリップキャップチューブ	サーモサイエンティフィック	362694
DNAse	インビトゲン	18047019
100 μM MACS SmartStrainer	ミルテニー	〒130-098-463	15 mLチューブと互換性があり、推奨
100 μmセルストレーナー	隼	352360	50 mLチューブに対応(MACSスマートストレーナーが利用できない場合)
96ウェルプレート	隼	353077
FCブロック	BDファーミンゲン	553142	アンチCD16/CD32
抗マウスCD45抗体	BDバイオサイエンス	561487	多くの異なる蛍光標識オプションが利用可能です
5 mLチューブ、ポリスチレン、フィルターキャップ付き	隼	352235
ハンドヘルドホモジナイザー	キアゲン	9001272	ティッシュラプター
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	該当なし	フォルテッサSORP
フローサイトメトリーソフトウェア	BDバイオサイエンス	該当なし	ディーバ