生体外臓器培養における細菌感染モデルを確立する技術

要約

出典:Rizzuto, G. A., et al. 母体と胎児のインターフェースでの感染を研究するためのヒト胎盤および落葉臓器培養。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、胎盤組織に感染モデルを確立して感染伝播を研究する方法を示します。ex vivo 胎盤臓器培養物は、通性細胞内寄生虫であるリステリア菌に感染しています。この細菌は、絨毛外性栄養膜(EVT)に侵入して胎盤組織に侵入し、細胞間拡散を通じて他の細胞に増殖します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 臓器培養プレートの調製

>注:次の手順は、組織培養フードで滅菌技術を使用して実行する必要があります。解剖顕微鏡を無菌領域に配置するのに理想的です。ただし、マイクロダイセクションが迅速に行われ、器具が70%エタノールに頻繁に浸される限り、これは絶対に必要ではありません。

1. 細胞外マトリックス(ECM)バイアルを氷上で解凍します。ECMを氷冷した収集培地で1:1に希釈し、ピペッティングで混合します。気泡が入らないようにゆっくりとピペットで挟んでください。6ウェル組織培養プレートの各ウェルには、この懸濁液が100μl必要で、3〜4個の臓器培養に対応します。
2. トランズウェルインサート(細孔径0.4 μM)を6ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れます。
3. 各トランズウェルインサートをECM/培地懸濁液の薄層 (100 μl) でコーティングします。
4. プレートを氷の上に置き、すぐに臓器培養の確立に進みます。あるいは、ティッシュを採取する前にプレートを準備し、その場合はパラフィルムで包み、後で使用するために4°Cで保存してください。ECMが乾燥するため、6時間を超える保管はお勧めしません。

2. オルガン文化の確立

>注:この手順では、落葉器官培養物と絨毛器官培養物を別々のトランズウェルに配置する方法について説明します。組織が接触していません。脱落膜と絨毛が直接接触する共培養技術に関心のある研究者は、先行文献を参照できます。

1. 検体をコレクション培地で2回すすぎ、各すすぎの間に1,000 x gで遠心分離します。組織を滅菌ペトリ皿に移し、解剖顕微鏡のステージに置きます。6ウェルプレートを顕微鏡に隣接する氷の上に置きます。
2. 滅菌スプリンガー解剖ハサミと鉗子を使用して組織をマイクロ解剖し、2〜3 mmの絨毛器官培養を確立します(図1A).
   手記：絨毛器官培養物は、2つまたは3つの枝を持ち、目立つ絨毛外栄養膜(EVT)細胞柱を持つ、小さくて血管新生した「木」です。ECMへの絨毛外絨毛芽球の浸潤はこれらの若い年齢で最も顕著であるため、<9週の妊娠初期標本からの絨毛組織のみを利用することが重要です。
3. 目立つEVT細胞カラムを持つ血管新生された絨毛を選択します。EVT細胞カラムは、球根状、「ファジー」、「フラッフィー」末端として視覚化されます(図1Aの矢印を参照)。
4. 滅菌鉗子を使用して、3本または4本の絨毛樹を各トランズウェルに移します。ツリーがECMの上に平らに配置され、固まったブランチを分離するようにブランチを調整します。
5. 滅菌スプリンガー解剖ハサミと鉗子を使用して脱落膜組織をマイクロ解剖し、3 mm³脱落膜器官培養を確立します(図1A).
   手記： 標本には、decidua parietalisとdecidua capsularisの2つの異なるタイプの脱落組織が含まれています(それぞれ左と右の組織片、図1A)。
6. はさみでトリミングして、3 mm³個のdecidua parietalisを作成します。Decidua capsularisはこれらの文化には使用されません。鉗子を使用して、凝固した母体血液をからかい取ります。
7. 滅菌鉗子を使用して、3〜4個のデシデュアを各トランズウェルに移します。
8. 1 mLの収集培地をウェルの底に加えます。プレートを5% CO₂中で37°Cで一晩インキュベートします。
9. 正常な妊娠初期の胎盤酸素圧を模倣することが重要な実験では、絨毛器官培養物を相対的低酸素症(3%O₂)に維持します
   手記：ラボのオプションには、既存のインキュベーター内に収まる小型の低酸素インキュベーターチャンバーや、外部_N2ガスを導入して酸素濃度を下げるトライガスインキュベーターなどがあります。
10. 12〜16時間の培養後、トランズウェルの上部に1mlの絨毛または脱落膜培地(表1)を追加します.
    手記：培養の最初の一晩で培地がないと、絨毛外細胞の栄養膜カラムが浸潤し(絨毛培養)、組織(絨毛と脱落膜の両方)がECMにしっかりと埋め込まれます。私たちの経験では、脱落膜器官培養は72時間生存可能であり、絨毛器官培養は96時間生存可能です。この期間内に収まる実験エンドポイントを推奨します。絨毛培地と脱落膜培地の組成については、表 1 を参照してください。絨毛培地は FBS の割合が高く、デシデュアル培地には、脱落膜状態を維持する妊娠ホルモン (プロゲステロン、17β-エストラジオール) が補充されています (表 1)。

3. L. monocytogenesの培養物の調製

>注:L. monocytogenesの長期保存、および脳心注入(BHI)ブロスおよび寒天におけるこの生物の培養と成長に関する詳細なプロトコルについては、Wang et al.を参照してください。

1. 縞模様のBHI寒天プレートからL. monocytogenesのコロニーを1つ選び、3 mLのBHIブロスを接種します。
2. L. monocytogenesの培養物を斜めの位置で一晩(16時間)インキュベートします。
   手記：これらの培養条件により、細菌の増殖は固定相に達することができます。L. monocytogenesは30°Cで鞭毛化され、宿主細胞の侵入が増加します。

4. L. monocytogenesによる臓器培養物の感染

1. 温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)および絨毛または脱落剤培地(表1)から37°C。
2. 滅菌ピンセットを使用して、ECMに侵入しなかったためウェルに浮いている臓器培養片をすべて取り除きます。
3. トランズウェルの底から培地を慎重に吸引します。1 mLの温かいPBSをウェルに静かにピペッティングし、その間に注意深く吸引することにより、上部と下部のトランズウェルを2回すすぎます。抗生物質を含まない絨毛またはデシデュアル培地1 mlを上部と下部のトランズウェルに静かにピペットで移します。臓器の培養を妨げないように注意してください。
4. 抗生物質が除去されたことを確認するために、組織を抗生物質を含まない培地で少なくとも1時間インキュベートします
   手記：固定相では、L. monocytogenes培養物の密度は、1 mLあたり約1 x 10⁹コロニー形成単位(CFU)です。臓器培養物に感染するために使用される細菌の数は、実験のニーズを満たすために経験的に決定されるべきです。
5. 野生型L.モノサイトゲネスの場合、ルーチン感染実験では、一晩で1:50に希釈した(ウェルあたり1mlの培地に4×10、⁷個のL.モノサイトゲネス)という強力な浸潤が示されています。抗生物質を含まない絨毛またはデシデュアル培地に適切な数の細菌を再懸濁します。.
6. トランズウェルの上部から培地を吸引します。1mlの接種物をそっと加えます。プレートを5% CO₂中で37°Cでインキュベートし、細菌の侵入を可能にします。
7. 上部および下部のトランズウェルから培地を吸引することにより、細胞外細菌を除去します。温かいPBSでウェルを2回すすぎます。50 μg ^ml-1 ゲンタマイシンを添加した 1 ml の絨毛培地または脱毛培地を加えます。プレートを 37 °C で 5% CO₂.
   中でインキュベートします。 注:L. monocytogenesは、細胞外培地で増殖し、細胞内で増殖し、細胞外空間にアクセスすることなく細胞から細胞へと広がることができる通性細胞内細菌です。ゲンタマイシンは、細胞外L.モノサイトゲネスに対して殺菌効果があるため、細胞内L.モノサイトゲネスの成長と臓器培養を介した広がりの測定が可能です
   手記：絨毛および落葉膜器官培養物の再現性のあるL.monocytogenes感染は、5時間のインキュベーション時間で発生します。ゲンタマイシンを添加する前のインキュベーション時間は、実験的なニーズと生物が組織に侵入する能力に基づいて変更することができます。感染に対して最も脆弱な解剖学的部位をよりよく理解するために、インキュベーション時間を短縮することができます。
8. 実験期間中、プレートを5%_CO2中で37°Cに保ちます。各ウェルのメディア全体を毎日交換してください.
   手記：私たちの経験では、L. monocytogenesに感染した脱落臓器培養は48時間生存し、絨毛器官培養は72時間生存します。

表 1: メディア レシピ。洗浄バッファー、収集培地、絨毛培地、およびデシデュアル培地の調製のための成分と濃度

ウォッシュバッファー	収集媒体	絨毛培地	デシデュアル媒体
PBSの	DMEM/F-12 と GlutaMAX	DMEM/F-12 と GlutaMAX	DMEM/F-12 と GlutaMAX
ペニシリン100IU / ml	ウシ胎児血清 2.5%	ウシ胎児血清 20%	ウシ胎児血清 2.5%
ストレプトマイシン100μg/ ml	ペニシリン100IU / ml	ペニシリン100IU / ml	17β-エストラジオール 300 pg/ml
ゲンタマイシン50μg/ ml	ストレプトマイシン100μg/ ml	ストレプトマイシン100μg/ ml	プロゲステロン20 ng / ml
アムホテリシンB 1.25μg/ml	ゲンタマイシン50μg/ ml
	アムホテリシンB 1.25μg/ml

結果

図1:絨毛器官の培養 - 代表的な肉眼的および顕微鏡的画像。

(A) 解剖顕微鏡で見た、妊娠期間6週間の2本の末端絨毛樹。「ふわふわした」端(矢印)と左側の木の枝を通る目立つ胎児の血管系が、この作品を臓器培養に適したものにしていることに注意してください。(B)リステリア菌の感染後72時間の臓器培養(在胎週数8.3週)の免疫蛍光顕微鏡検査、絨毛外性栄養膜における重い細菌負荷[緑]を強調しています。DAPIは青、βHCG+合胞体栄養芽球は赤で示されています。スケールバー = 1 mm (A)、250 μm (B)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌ポーチ	フィッシャーサイエンティフィック	01-812-54	個々の解剖ツールのオートクレーブ用
ファインメッシュストレーナー	クイジナート (Amazon.com)	NAの	ティッシュを採取する前に、アルミホイルとオートクレーブで完全に包みます。
スピゴット付きカーボーイ	フィッシャーサイエンティフィック	03-007-647	ウォッシュバッファーの大量調製用。
アイスパック	Nortechラボ	GB8818	これらは購入する必要はなく、パッケージに含まれる通常のラボ出荷からリサイクル/再利用できます。
70%エタノール	VWRの	V1001	190または200プルーフの研究用グレードのアルコールにdH20を添加して作られた70%溶液。
漂白剤10%	ワクシーサニタリーサプライ	CLOの30966	dH20を添加して作られた10%溶液。
ライトボックス	ライトボックスルミナ (dickblick.com)	55305から2009	交換用電球はBlick(55305.0100)でも購入されていることに注意してください
マイクロ解剖鉗子	ストールティング	52102から43	4インチ、1x2 0.5mm、わずかなカーブ
マイクロ解剖鉗子	ストールティング	52102から06	4インチ、ストレート、ファイン、シャープ
マイクロ解剖バンナスプリングハサミ	ストールティング	52130から01P	McPherson-Vannas スプリングはさみ、8.5cm、0.33 チップ、わずかに湾曲
解剖顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	MZ16またはM60	リストされたモデルで成功を収めています。外部グースネックフレキシブル光源は便利ですが、必須ではありません。
50 mLコニカルチューブ	Sigma-Aldrich(コーニング)	CLS4558
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	10010023	私たちは大学の組織培養コア施設から購入しますが、このような代替オプションが利用可能です。
10X リン酸緩衝生理食塩水	テクノバ	P0195	洗浄バッファーの調製には、10X PBSを使用します
DMEM/F-12 栄養素混合物 (ハム) と GlutaMAX	Gibco(ライフテクノロジーズ)	〒10565-018	2.438 g/L重炭酸ナトリウム、55 mg/Lピルビン酸ナトリウム、および4.5 g/Lグルコースを含むこの特定の培地製剤を購入します
ゲンタマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15710072	1000倍在庫。凍結/融解を避けるために、アリコートを-20°Cで調製して保存することをお勧めします。
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	15140-122	100倍ストック。凍結/融解を避けるために、アリコートを-20°Cで調製して保存することをお勧めします。
アムホテリシンB	Gibco(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	15290から018	500倍ストック。凍結/融解を避けるために、アリコートを-20°Cで調製して保存することをお勧めします。
プロゲステロン	シグマ・アルドリッチ	P8783	1 mMのストック溶液は、15.7 mLのプロゲステロン粉末を15.7 mLのエタノールに再溶解し、34.3 mLのPBSを添加して調製します。溶液は滅菌ろ過され、分注され、-20°Cで保存されます。
17β-エストラジオール	シグマ・アルドリッチ	E2758	10 μMのストック溶液は、13.5 mgのエストラジオール粉末を10 mLのエタノールに再溶解し、40 mLのPBSを添加して調製します。溶液は滅菌ろ過され、分注され、-20°Cで保存されます。
ボトルトップ真空フィルター(0.22μm)	Sigma-Aldrich(コーニング)	CLS430769	調製後の収集培地の滅菌ろ過用
6ウェル組織培養プレート	BDファルコン	353224	ポリスチレン、組織培養処理
6ウェルトランズウェル	ミリポア	PICM03050	インサート - 直径30mm、孔径0.4μmの親水性PTFEメンブレン
細胞外マトリックス(例えば、マトリゲル基底膜マトリックス)	BDバイオサイエンス	354234	私たちは研究にマトリゲルマトリックスを利用しました。室温および-20°Cで固体です。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。ボトルを4°Cの粘性溶液に解凍し、冷蔵室で冷やしたピペットチップで~300μLのアリコートを調製します。アリコートは-20°Cで保存してください。
パラホルムアルデヒド、16% w/v 水溶液	アルファ・アエサル	30525-89-4	組織固定のために、このストックをPBSで希釈することにより、4%パラホルムアルデヒドの新鮮な調製物が作られます。
組織培養インキュベーター、37°C、5%CO2、3%酸素(絨毛器官培養用オプション)			一部の実験では、低酸素症が好まれる場合があります。これは、ガスボンベ、タイゴンチューブ、レギュレーターを介した外因性窒素の添加など、複数の方法で確立できます。
ベンチトップ遠心分離機

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