マラリア-HIV同時感染のin vitro細胞培養モデルの生成

要約

出典:Finney, C. et al., HIV重複感染の文脈でマラリアに対する免疫応答を測定するためのIn Vitroモデル。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、in vitroでのマラリア-HIV同時感染細胞培養モデルの生成を示しています。熱帯熱マラリア原虫に寄生した赤血球と共培養したHIV感染末梢血単核細胞は、互いの成長をサポートし、HIVとマラリアの同時感染における免疫応答と疾患の進行に関する洞察を提供する可能性があります。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>注意:人間の血液サンプルと人間のマラリア原虫を扱うには、予防措置が必要です。常に白衣と手袋を着用し、レベル2のバイオセーフティキャビネットで作業してください。誤ってヒトマラリアに経皮的にさらされた場合は、予防的治療のためにHealth and Safetyに報告してください。.また、ヒト免疫不全ウイルスHIV(+)血液を扱うための安全性についても、安全性に関する追加の考慮事項を設ける必要があります。バッククロージングの白衣を着用してください。ダブルグローブ(トップグローブはラテックス製)。すべての取り扱いは、レベル2のバイオセーフティキャビネットで行ってください。ガラスや鋭利なものは使用しないでください。吸引器は使用しないでください。すべての汚染されたアイテムをウイルス溶液または漂白剤に入れてから、廃棄する前に最低1時間保管してください。使用後1時間、すべての表面をウイルスと紫外線(UV)で洗います。各機関には、従う必要のある独自のバイオセーフティ規制があることに注意してください。HIV感染血液へのすべての偶発的な曝露をHealth and Safetyに報告し、曝露後の予防の可能性を評価および検討してください。

>注:熱帯熱マラリア原虫にはさまざまな株が存在します。これらの実験にはITGを使用しましたが、異なる菌株を使用することもできます。熱帯熱マラリア原虫の凍結と解凍に関する優れた説明は、MR4のWebサイトで入手できます。

1. マラリア原虫培養のためのRPMI-Aを作る

1. 950 mlの再蒸留水(ddH₂O)、1パケットのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)-1640粉末、6 gのN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、2 gの重炭酸ナトリウム、および1.35 mgのヒポキサンチンを混合してRPMI-0を作成します。
2. 2つの異なるドナーから採取した熱不活化ヒト血清を解凍します。ABドナーが最適ですが、寄生虫がO型赤血球(RBC)で増殖している場合は、どれでも使用できます。チューブを反転させて混合します。血清に粒子状物質が含まれている場合や濃厚な場合は、2,000rpmでスピンし、0.45μmのフィルターユニットで液体部分をろ過してください。
3. 0.2 μmのフィルターユニットを使用して、180 mlのRPMI-0、20 mlのヒト血清(各ドナーから10 ml)、および0.5 mlの10 mg / mlゲンタマイシンをろ過します
   手記：ヒト血清はフィルターを詰まらせる可能性があるため、複数のフィルターユニットが必要になる場合があります。
4. ミディアムボトルにRPMI-A、日付、および血清の供給源をラベル付けします。必要になるまで冷蔵します。RPMI-Aは冷蔵すると曇りになる場合があります。これは正常ですが、曇りが増すのは汚染の兆候です。
   手記：寄生虫の増殖は、ドナー血清によって異なる場合があります。使用する前に、すべてのヒト血清バッチで寄生虫の増殖が良好かどうかをテストすることをお勧めします。

2. 寄生虫培養のためのヒト赤血球の準備

>注:献血者はO型である必要があります。

1. 7〜10 mlの血液を酸-クエン酸-デキストロース(ACD)チューブに集めます。ラベルに寄付者のIDと収集日を記入します。
2. 必要になるまで血液を4^°Cで保存します。寄生虫の培養には1ヶ月以内に血液を使用してください。
3. チューブの上部を70%エタノールで拭きます。ストッパーは慎重に取り外して廃棄してください。血液を15mlのチューブに移します。1,000 x gで3分間回転します。吸引によりプラズマを除去します。
4. RBCを同量のウォームRPMI-0でサスペンドします。1,000 x gで5分間回転します。バフィーコートを吸引して取り除き、5mlのRPMI-0に再懸濁し、さらに2回洗浄を繰り返します。
5. 上清を取り除き、十分な量のRPMI-Aを加えて、体積で50%のRBCの混合物を生成します。
6. 必要になるまで4^°Cで保管してください。

3. 寄生虫の培養の維持

1. RPMI-Aを37^°Cまで温めます。
2. 解凍した寄生虫 (解凍手順については MR4 プロトコルを参照) を T25 フラスコに入れ、5 ml の RPMI-A と 75 μl の洗浄したヒト RBC を入れて、ヘマトクリット値を ~3% にします。手記：ヘマトクリットは、総量と比較したRBCの量を測定します。ヘマトクリット値を計算するには、パックされたRBCの量を培地とRBCの合計量に測定します。解凍した寄生虫が75μlのRBCに寄与すると仮定します。150 μlのRBCストック(75 μlのパックされたRBCを添加することに相当)をフラスコに加えると、5 mLの培地に合計150 μlのRBCが入り、ヘマトクリット値は3% (150 μl/5,000 μl x 100% = 3%)になります。
3. 寄生虫ガス混合物(1%O₂、3%CO₂、バランスN₂)でフラスコを30秒間ガス化します。フラスコの幅広を下にして37^°Cのインキュベーターに密封し、ガス交換の最大の表面積を確保します。
4. 培地を交換して寄生虫症をチェックするには(毎日行う必要があります)、RBC層を乱さないようにフラスコを慎重に動かします。滅菌済みのプラグを抜いたパスツールピペットを使用して、血液層を乱さずに培地を取り出します。
5. 寄生虫血症を調べるには、血液層から10μlのサンプルを取り出し、スライドガラスの上に置き、2枚目のスライドガラスを使用して薄い血液膜を作成します。スライドを乾かします。
6. 新鮮なRPMI-A4 mLをフラスコに入れ、ガスで30秒間穏やかに混合し、37°Cのインキュベーターに入れます。
7. Hema3染色キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってスライドを染色します。
   1. 最適な染色のために、スライドを固定液に10秒間、溶液Iに10秒間、溶液IIに30秒間浸漬します。
8. 熱帯熱マラリア原虫RBC、PfRBC(濃い紫色に染色された)とRBCの総数(ピンク色に染色された)の数を数えて、寄生虫症を計算します。精度を確保するために、合計300個のセルをカウントします。
9. 寄生虫が寄生虫症が5%に達したら、40 mLのRPMI-Aと500 μlのRBCを使用して、培養物をT75フラスコに拡大します。

4. 寄生虫の同期

注:実験の前日に、寄生虫の培養物をアラニンで処理して同期させます。この治療を生き残るのは、リングステージの寄生虫と感染していないRBCだけです。アラニンの同期により、翌日には純粋な栄養型培養が得られ、共培養実験に使用することができます。リングステージの寄生虫の大部分を含む寄生虫培養物から始めるようにしてください。

1. 8.01gのアラニン(300mM)と0.365gのトリス(10mM)を300mlのddH₂Oに混合してアラニン溶液を調製し、pHを7.4にします。0.2μmのフィルターユニットを使用してフィルター滅菌します。
2. アラニン溶液を37^°Cに予熱します。
3. 寄生虫培養物をスピンダウン(5分×1,000×g)し、培地を取り出します。
4. ペレットを19容量のアラニン溶液(1 mLに詰めたRBCから19 mLのアラニン溶液)に再懸濁します。室温(RT)で15分間インキュベートします。
5. スピン 5分 x 1,000 x g. 上清を吸引します。RPMI-0で一度洗ってください。上清を吸引し、RPMI-Aに再懸濁し、ヘマトクリット値を~3%に調整します。ガスフラスコと37^°Cに戻ります
   手記：共培養実験では、最小5%の栄養型寄生虫が必要であり、10%の寄生虫が最適であると考えられています。

5. 共培養実験のための寄生虫と赤血球の調製

1. 共培養実験では、PBMCあたり3 PfRBCの比率を使用して、炎症反応を誘発します。総PfRBCを計算するには、3.5に記載されているように薄い血液塗抹標本を作成して寄生虫血症を定量化し、血球計算盤を使用して寄生虫培養物のmLあたりのRBCの数を数えることによりヘマトクリットを定量化します><。 PfRBCの数=寄生虫症の割合×総RBC/ml×培養液のml。例えば、10 x 10⁶ RBC/mlおよび10%寄生虫症の10 mlの培養物は、0.1 x 10⁶/ml x 10 ml = 10 x 10⁶ PfRBCに等しい。
2. 寄生虫培養物を1,000 x g(RT)で5分間回転させます。培地を吸引し、RPMI-S+(L-グルタミンとHEPESを添加した500 mL RPMI-1640、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、1.5 mLのゲンタマイシン、5 mLの100 mMピルビン酸ナトリウム、5 mLの10 mM MEM非必須アミノ酸、5 mLの5 mM β-メルカプトエタノール)に1 mLあたり6 x 10 6 PfRBCで再懸濁します。
3. コントロール血液(寄生虫培養の維持に使用されたのと同じドナーからの感染していないRBC)を採取し、ヘマトクリットを計算し、寄生虫培養物と同じmlあたりのRBC数でRPMI-S+に再懸濁します。

>6. ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の単離

1. 慢性HIV(+)ドナーとHIV(-)コントロールの両方からナトリウムヘパリンチューブ(グリーントップ)に静脈血を採取します。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、EDTAのカルシウムキレート作用が細胞機能に影響を与えるため、抗凝固剤として使用しないでください。平均して、血液10mlあたり5〜10 x 10⁶ PBMCを期待しています。典型的な実験では、各ドナーから30mlの血液を採取します。血液量は、実験要件に応じて調整する必要があります。
2. できるだけ早く、そして確実に採血後1時間以内に、チューブから血液を取り出し、プラスチック製の50mlチューブに入れます。特に単球は活性化してガラスにくっつくため、ガラス製の採血管を使用する場合は、できるだけ早く細胞を切除することが重要です。
3. 血液を1,000 x gで15分間回転させ、血漿を採取します(これは必要に応じて他の研究に使用できますが、そうでない場合はこのステップをスキップできます)。等量の冷たいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で血液を希釈します。
4. 15 mLのRT Ficollを50 mLのチューブに入れます。滅菌済みのプラスチック製トランスファーピペットを使用して、血液/DPBS溶液を混合せずにFicoll上にゆっくりと重ねます。最大25 mlの血液/ DPBS溶液をFicoll 15 mlごとに重ねることができます。.
5. RTで600 x gでグラディエントを30分間回転させ、「ブレーキなし」の設定がオンになっていることを確認します。
6. 細胞が回転したら、2つのフェーズ間のインターフェースを探します。これがPBMCがある場所です。滅菌プラスチックトランスファーピペットを使用して、インターフェースからPBMCを回収します(図1を参照)。RBCによる汚染を最小限に抑えます。
7. 採取した細胞を50mlのチューブに入れ、チューブあたり20ml以下で入れます。滅菌コールドDPBSを備えた最大50mlのトップチューブ。
8. 細胞を4^°C、300 x gで10分間回転させます。
9. 上清を捨て、ペレットを5 mLの滅菌冷DPBSに再懸濁し、同じドナーからのすべての細胞を1つのチューブにプールします。滅菌DPBSを最大50mlまで補充し、洗浄手順をさらに2回繰り返します。
10. 細胞を10 mLのRPMI-S+培地に再懸濁します。
11. 20 μlのアリコートを取り出し、20 μlのトリパンブルーと混合します。血球計算盤で10μlをピペットで動かし、生細胞(青色色素を取り込んでいない細胞、つまりすべての青色細胞が死滅している細胞)をカウントします。血球計算盤を使用して、溶液中の細胞数を次のように計算します。
    手記：血球計算盤には、線で覆われた領域がわかるように、指定された寸法のグリッドがあります。
    1. 血球計算盤が汚れていないことを確認してください。カバースリップをカウントエリアの上に置きます。ピペットチップをV字型ウェルの1つにセットして、10 μlのセル溶液をロードします。カバースリップの下の領域は、毛細管現象によって埋められます。
    2. ロードした血球計算盤を顕微鏡下に置きます。血球計算盤のフルグリッドには、それぞれ1 mm²の9つの正方形が含まれています。各大きな正方形内のすべてのセルを数えます。細胞が多すぎる場合は、溶液をさらに希釈して再計数します。
    3. 細胞濃度を次のように計算します:総細胞数/ml = (カウントされた総細胞数/#平方)×希釈係数×10,000細胞/ml、例えば、(500細胞/5平方)×希釈係数20×10,000細胞/ml=20×10⁶細胞合計。
12. 培地を最終濃度10 x 10⁶ / ml(RPMI-S +培地)に調整します。

>7. マラリア/HIV同時感染文化

1. 100 μlの単離PBMCSと400 μlのRPMI-S+培地を24ウェルプレートにプレートします(ウェルあたり1 x 10⁶ PBMC)。ウェルが3つのウェルに非感染のRBC用、3つのウェルにPfRBC用、3つのウェルに中程度、3つのウェルにPMA/イオノマイシンがセットされているという3つのウェルでセットアップされていることを確認します。これは、HIV(+)サンプルとHIV(-)サンプルの両方に適用されます。
2. PfRBCウェルの場合は、各ウェルに3 x 10⁶ PfRBCを配置します(5.2で調製した寄生虫培養物500μl)。
3. 未感染のRBCウェルの場合は、5.3で調製した未感染のRBC培養物500μlを各ウェルに入れます。
4. 中ウェルの場合は、各ウェルに500 μlのRPMI-S+培地を置きます。
5. PMA/イオノマイシンウェルの場合は、PMA/イオノマイシン溶液(それぞれ2.5 pg/ml、250 pg/ml)を調製します。この溶液を各ウェルに500μl入れます.
   手記：T細胞サイトカイン分泌の強力な刺激因子として、PMAとイオノマイシンは、細胞が機能していることを確認するためのポジティブコントロールとして使用されます。
6. プレートを37^°Cで5%_CO2インキュベーターに入れます。
7. オプション:フローサイトメトリーを使用した表現型解析に余分な細胞を使用するか、将来のmRNA発現解析のためにRNA安定化溶液に保存してください。

8. マラリア免疫応答の検出

>注:共培養実験は4日間まで行ってください。この間、媒体の変更は必要ありません。最適な時点は、関心のある細胞の種類と尋ねられる質問によって異なります。12〜48時間のインキュベーションは、PfRBCに対する単球反応に最適であり、リンパ球反応は72〜96時間で最もよく観察されました。タイムポイントは、実験的な問題に基づいて最適化する必要があります。無傷のPfRBCとPBMCとの間の相互作用が興味深い場合は、より短い期間(2〜4時間)を使用できます。

1. プレートを300 x gで3分間スピンし、細胞をペレット化します。各ウェルから700 μlの培養上清を回収します。
2. 上清を1,000 x gで5分間回転させ、破片を取り除きます。
3. 必要に応じて上清をクリアしたアリコート、標識、および分泌因子の分析が行われるまで-20°C未満で凍結します。.

結果

図 1. PBMCの位置を示すスピン後のFicoll勾配の描写。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アラニン	シグマ	A7377 (英語
BDバキュテナーACDソリューションA	BDの	364506
BDバキュテナーヘパリンナトリウム	BDの	17-1440-02
DPBS(カルシウム、マグネシウムなし)	コーニング	21-031-履歴書
ウシ胎児血清	シグマ	F1051	使用前の熱不活性化
フィコール・パケ・プラス	GEヘルスケア	17-1440-02
ゲンタマイシン(10mg/ml)	ギブコ	15710-064
Hema3染色セット	漁夫	〒122-911
ヘープス	漁夫	BP310-500
ヒポキサンチン	シグマ	H9636-J
イオノマイシン	シグマ	I3909
MEM非必須アミノ酸(10mM)	ギブコ	11140
PMAの	シグマ	P8139
RPMI-1640パウダー	ライフテクノロジー	〒31800-022
RPMI-1640 と L-グルタミンと HEPES	サーモサイエンティフィック	01 SH30255月
重曹(粉末、細胞培養)	シグマ	S5761
ピルビン酸ナトリウム(100mM)	ギブコ	11360
トリス(トリズマベース)	シグマ	T6066
トリゾール	アンビオン	15596018
トリパンブルー(0.4%)	ギブコ	15250-061
寄生虫ガス混合物	特別注文で		3%CO2、1%O2、バランスN2

) の 型 型