同種骨髄移植および脾細胞移植によるマウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導

要約

出典:Buchele, V., et al. 生きたマウスにおける腸移植片対宿主病の誘導とそのミニ内視鏡的評価。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、同種造血幹細胞とGvHD誘導脾臓同種性Tリンパ球を使用して、致死放射線を照射したレシピエントマウスにおける腸移植片対宿主病、GvHDの誘導を示しています。このプロトコルは、疾患のメカニズムを理解し、革新的な治療オプションを開発するための重症急性腸GvHDモデルを確立するのに役立ちます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. GvHD導入

1. 0日目:レシピエントマウスの全体照射
   1. レシピエントとして、少なくとも10週齢の雌のCD45.2+ H2kd+ BALB/cマウスを使用してください。
   2. GvHD導入前にレシピエントマウスの体重を量り、記録します.
      手記：レシピエントの体重が20g以上であることを確認してください。開始時の体重は、GvHD の誘導と進行の過程で個々のマウスの体重減少を計算するための基準値として機能します。
   3. X線照射器の容器に最大5匹のマウスを入れます。
   4. マウスに全身放射線を照射し、8GyのX線を単回照射します。放射線源としてCs137を使用してください。
2. 1日目:照射マウスのT細胞枯渇骨髄の再構成
   手記： 同種骨髄細胞の移植は、セクション1.2で概説および詳述されているように、照射後24時間以内に行われるべきである。滅菌組織培養フードで以下に記載する手順を実行し、ろ過試薬を使用してください。同種CD45.1/Ly5.1 B6を使用してください。SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrlマウスをT細胞枯渇骨髄のドナーとして作製しました。
   1. CD45.1 / Ly5.1 B6を安楽死させます。SJLマウスは、施設のガイドラインに従って、レシピエントBALB/cマウスの照射から12〜24時間後に同種骨髄細胞を提供します。このためには、CD45.1 / Ly5.1 B6を麻酔します。5%イソフルランの吸入によるSJLマウス。呼吸停止後1分以上イソフルラン曝露を続行し、頸部脱臼による安楽死を確認します。.
   2. マウスの毛皮と皮膚を70%エタノールで徹底的に消毒します。
   3. マウスを清潔な作業用シースに配置して、マウスが腹臥位になり、後肢が実験者に向けられるようにします。長さ13 cmのSemken鉗子の先端と鋸歯状の湾曲した先端でアキレス腱の毛皮を持ち上げます。鉗子とかかとの間の皮膚を、先端がまっすぐな硬化した8.5cmの細いハサミで切開します。
   4. 切開部を頭蓋骨方向に伸ばします(つまり、かかとから下腿と太ももを越えて股関節領域まで)。鉗子の助けを借りて後肢から皮膚と毛皮を取り除きます。
   5. もう一方の後肢についても同じ手順を実行します。
   6. 隣接する股関節を切断して後肢を切除します。
   7. 後足を切り取ります。膝関節を切断します。すべての後肢の大腿部とすね部を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷上に充填した92mmのシャーレに一緒に保管します。
   8. 大腿骨と脛骨の骨は、大腿部とすね部からできるだけ多くの筋肉組織を取り除いて、慎重に清掃します。大腿骨と脛骨を滅菌RPMI 1640培地で満たされた50mLチューブに移し、ステップ1.2.7で採取したすべての脛骨と大腿骨が筋肉組織からきれいになるまで湿った氷の上に置きます。
   9. 骨髄を単離するには、一度に1つの大腿骨または脛骨(ステップ1.2.8で説明したように洗浄済み)を50mLチューブからRPMI 1640培地で満たされたシャーレ(直径92mm)に移します。大腿骨または脛骨の端をメスで切り取り、骨髄を含む骨の空洞にアクセスします。
   10. 50 mLの収集チューブに5 mLのRPMI 1640培地を調製します。1 mL の RPMI 1640 培地を充填した 1 mL シリンジに取り付けた 26 G の針を骨腔に挿入し、プランジャーを押して骨髄を腔から採取チューブに流します。
   11. 骨が明るく光沢があるように見えるまで(つまり、骨腔に赤みがかった骨髄が見えないようになるまで)、手順1.2.10を繰り返します。空のボーンを捨てます。
   12. ステップ1.2.8のすべての大腿骨と脛骨を使用して、ステップ1.2.9〜1.2.11を繰り返し、ステップ1.2.10と同じ50mLコレクションチューブに回収されたすべての骨髄片を採取します。ステップ1.2.8のすべての骨がそれに応じて処理されるまで、収集チューブを濡れた氷の上に置いておきます。
   13. 洗い流され、砕けやすい骨髄片を上下に柔らかくピペッティングすることにより、単一細胞懸濁液を作成します。骨髄単一細胞懸濁液を、新しい50 mLコレクションチューブに載せた40 μmメッシュスクリーンセルストレーナーでろ過します。
   14. 骨髄単細胞懸濁液を含む50 mLの採取チューブを450 x gで4°C、5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   15. ペレットを5 mLのACK溶解バッファー(1 mM Na²EDTA、10 mM KHCO₃、144 mM NH₄Cl、pH 7.2)に再懸濁して、赤血球溶解を行います。細胞懸濁液を室温で3分間インキュベートします。その後、すぐに10 mLのPBS溶液を細胞懸濁液に加えます。
   16. 懸濁液を450 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、細胞を2 mLのPBS溶液に再懸濁します。
   17. 血球計算盤を使用して骨髄細胞を数えます。フローサイトメトリー分析のために6 x 10⁶細胞のアリコートを保存し、細胞精製後の細胞の純度を確認します(ステップ1.2.20を参照)。
   18. 骨髄単一細胞懸濁液からT細胞を枯渇させるには、市販の細胞精製キットを使用してください。全骨髄細胞からCD90.2+細胞(すなわち、リンパ球)を磁気的に枯渇させます、メーカーのプロトコルに従って。
   19. ステップ1.2.18で説明したように単離されたT細胞が枯渇した骨髄細胞を、血球計算盤を使用してカウントします。ステップ1.2.20.
       で説明されているように、後で実施するフローサイトメトリー分析のために、1 x 106細胞のアリコートを保存します 手記： 1匹のドナーマウスから得られる平均細胞収量は、通常、2 x 107から3.4 x 107のT細胞枯渇骨髄細胞です。
   20. フローサイトメトリーにより、T細胞の枯渇が成功したことを確認します。ステップ1.2.17(磁気細胞分離前の骨髄細胞)および1.2.19(磁気細胞分離後のT細胞枯渇骨髄細胞)から保存した1 x 10⁶細胞を、α-CD45.1(A20)、α-CD3(17A2)、α-CD4(GK1.5)、およびα-CD8α(53-6.7)の抗体で染色します。ステップ1.2.17の残りの細胞を未染色コントロールとして使用し、シングル染色コントロールとしてフローサイトメーターをセットアップします。
       1. 各サンプルから1 x 10⁶細胞をV底を有する96ウェルプレートのウェルに移し、フローサイトメトリー染色手順を実行します。
       2. 96ウェルプレート内の細胞をスピンダウンし(ステップ1.2.20.1)、4°Cで450 x gで5分間、上清を廃棄し、細胞を100 μLのFACSバッファー(PBSに3%ろ過ウシ血清を添加)に再懸濁します。
       3. 96ウェルプレート内の細胞を450 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
       4. 選択した抗体を適量(ステップ1.2.20と比較)をサンプルに添加し、100 μLのFACSバッファーで1回染色します。
       5. 磁気T細胞の枯渇前(ステップ1.2.17を参照)と後(ステップ1.2.19を参照)から保存された骨髄細胞アリコートを別々に染色するのに十分な量を含むすべての抗体(マスターミックス)の混合物を調製します。両方のアリコートに100μLのマスターミックスを加えます。
       6. 未染色のサンプルに100 μLのFACSバッファーのみを加えます。
       7. 96ウェルプレート内の細胞を暗所で4°Cで20分間インキュベー
       トします。
       8. 100 μL の FACS バッファーを添加し、96 ウェルプレート内の細胞を 450 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を 100 μL の FACS バッファーに再懸濁します。
       9. 細胞を450 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、細胞を250 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
       10. サンプルを5 mLのポリスチレン丸底チューブに移し、細胞サンプルの特性評価に使用した抗体の標識に使用された蛍光分子を検出できるフローサイトメーター装置で分析します(ステップ1.2.20を参照)。
       11. 磁気セル分離の前後の細胞組成を比較します.
           手記： 通常、ライブゲート内の約95%のCD45.1+CD3-(すなわち、T細胞が枯渇した骨髄)細胞の純度が達成されます。
   21. T細胞が枯渇した骨髄細胞懸濁液をPBS溶液(4°Cで5分間450 x g)で2回洗浄し、最後にPBS溶液で細胞を再懸濁し、細胞濃度を5 x 10⁷細胞/mLに調整します。注入まで細胞を濡れた氷の上に置いてください。
   22. 前日に照射したレシピエントマウスにT細胞が枯渇した骨髄細胞を注入します(セクション1.1を参照)。
       1. 実験マウスを漏れ防止チャンバーに入れ、マウスが意識を失うまで最大4%イソフルランを吸入して麻酔を誘発します。立ち直り反射の喪失とその後のペダル離脱反射の喪失をテストすることにより、鎮痛と意識喪失を確認します。
       2. PBS溶液を含む5 x 10⁶ T細胞枯渇骨髄細胞(すなわち、30 G針を備えた1mLシリンジを使用して100 μLの5x10⁷細胞/ mL)を静脈洞を含む球後腔に静脈内注入します。.
3. 2日目:T細胞
   の転写 手記：滅菌組織培養フードで以下の手順を実行し、ろ過試薬を使用してください。CD45.2 C57Bl/6(野生型;WT)マウスを同種性T細胞のドナーとして使用します。コンジェニックマーカーシステムの使用により、レシピエント(CD45.2+ H2kd+ Balb/cマウス)とドナー造血細胞タイプ(骨髄細胞:CD45.1+ H2kb+ B6)の区別が可能になります。SJLマウス;同種T細胞:CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6マウス)。
   1. C57Bl/6マウスを、適用機関のガイドラインおよび当局に従って安楽死させます。したがって、マウスを5%イソフルランの濃度で吸入して麻酔します。呼吸停止の1分後までイソフルラン曝露を継続し、頸部脱臼による安楽死を確認します。.マウスの毛皮と皮膚を70%エタノールで徹底的に消毒します。
   2. 40 μmメッシュスクリーン付きのストレーナーを50 mLコレクションチューブに置きます。脾臓を取り外し、ストレーナーの上に置きます。
   3. シリンジプランジャーで、ストレーナーで脾臓を粉砕します。ストレーナーとシリンジプランジャーをPBSで洗浄し、すべての脾細胞を採取します。
   4. 50 mLコレクションチューブ内の細胞を450 x gで4°C、5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   5. 脾臓細胞を3 mLのACK溶解バッファーに再懸濁して、赤血球を溶解します。細胞懸濁液を3分間インキュベートします。その後、PBS10 mLを添加し、細胞を450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を捨てて、脾臓細胞をPBSに再懸濁します。
   6. 血球計算盤を使用して、脾臓細胞を数えます。6 x 10⁶細胞のアリコートをフローサイトメトリー分析に転用し、ステップ1.3.9で精製の大きさを評価します。
   7. 全脾細胞からCD3+ T細胞を全単離するには、市販の細胞精製キットを使用してください。メーカーのプロトコルに従って、脾臓T細胞を単離します。
   8. ステップ1.3.7で説明したように単離した脾臓CD3+ T細胞を、血球計算盤を用いてカウントします。フローサイトメトリー解析のために1 x 10⁶ T細胞のアリコートを保存します.
      手記： 磁気細胞分離によって単離されたドナーマウスあたりの脾臓T細胞の平均収量は、1.3 x 10⁷から2 x 10⁷細胞の範囲です。
   9. フローサイトメトリーによるT細胞の単離の成功を確認します。染色プロトコルの詳細な説明については、1.2.20.1 - 1.2.20.10 に相談し、それに従ってください。
      1. ステップ1.3.6(磁気細胞分離前)および1.3.8(磁気細胞分離後)の⁶つの脾細胞1 x 10を、α-CD45.2(104)、α-CD3(17A2)、α-CD4(GK1.5)、およびα-CD8α(53-6.7)の抗体で染色します。
      2. ステップ 1.3.6 の残りの細胞を未染色コントロールとして使用し、それぞれの抗体による単回染色に使用して、フローサイトメーターをセットアップします。
      3. 磁気細胞分離前後の細胞組成を比較.
         手記：リンパ球ライブゲート内のCD45.2 + CD3 + T細胞の≥95%の純度を達成する必要があります。
   10. T細胞をPBS(450 x g、4°Cで5分間)で2回洗浄し、最後に細胞をPBS溶液に再懸濁し、細胞濃度を7 x 10⁶細胞/mLに調整します。注入まで細胞を氷上に保ちます。
   11. 以前にCD45.1 + T細胞枯渇骨髄細胞を投与されたことのある照射BALB / cマウスに、同種反応性の脾臓T細胞(ステップ1.3.10を参照)を注入します(ステップ1.2.22を参照)。
       1. 実験マウスを漏れ防止チャンバーに入れ、意識を失うまで最大4%のイソフルランにさらされて麻酔を誘発します。立ち直り反射の喪失とその後のペダル離脱反射の喪失をテストすることにより、鎮痛と意識喪失を確認します。
       2. PBS溶液(ステップ1.3.10を参照)を含む30G針(すなわち、7 x 10⁶細胞/mLの100μL)を備えた1mLシリンジを使用して、0.7 x 10⁶アロアアクティブCD3+ T細胞をマウスの球後腔に静脈内注入し、GvHDを誘導します。
       3. 100 μL の PBS のみを投与した別のマウス群を球後腔に静脈内注入し、このグループを対照群としてデノミネートし、その後「T細胞移植なし(noT)マウス」と呼びます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BIOBEAM 2000 ガンマ線照射器	ガンマ・サービス・メイカル社
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	シグマ・アルドリッチ(株)	D8662-6x500ミリリットル
セムケン鉗子(長さ:13 cm、鋸歯状、湾曲した先端)	ファインサイエンスツール	11009から13
硬化ファインハサミ(長さ:8.5cm、ストレートチップ、刃先:24mm)	ファインサイエンスツール	14090から09
RPMI-1640 ミディア	シグマ・アルドリッチ(株)	R8758-500ミリリットル
皮下注射針(26G)	B.ブラウンメルズンゲンAG	4657683
1 mLシリンジ	B.ブラウンメルズンゲンAG	9166017V
50mLチューブ	ザルシュテット農業 & Co.KG	6,25,47,254
40 μmメッシュスクリーンを備えたセルストレーナー	BDファルコン	352340
インスリン注射器(滅菌内部付き)(30G)	BDの	324826
Pan T Cell Isolation Kit II, マウス	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-095-130	脾臓T細胞を単離するための磁石細胞分離
CD90.2 MicroBeads、マウス	ミルテニーバイオテックGmbH	〒130-049-101	T細胞が枯渇した骨髄細胞を単離するための磁石細胞分離
生検鉗子	KARL STORZ SE & Co KG	61071 ZJの	大腸内視鏡検査の実験セットアップの一部
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(Na2EDTA)	カール・ロスGmbH & Co.KG	8043.2	ACK溶解バッファーの成分
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 抗体 (clone: 104; lot: B252126;RRIDの番号AB_493731)	バイオレジェンド	109822
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 抗体 (clone: A20; lot: B217246;RRIDの番号:AB_1134168)	バイオレジェンド	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a 抗体 (clone: 53-6.7, lot: B247008;RRIDの番号AB_312753)	バイオレジェンド	100714
フォラン/イソフルラン	株式会社アッヴィ	B506
濾過ウシ血清	パンバイオテック	品番40-47500	FACS緩衝液の成分