マイクロインジェクションによる腸管オルガノイドの寄生虫感染を発症する技術

要約

出典:Dutta, D., et al. Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、ヒト腸オルガノイド感染モデルを開発するためのマイクロインジェクション技術を示しています。寄生虫Cryptosporidium parvumの感染性スポロゾイト期は、オルガノイド内腔にマイクロインジェクションされます。オルガノイドの上皮細胞に侵入すると、無性生殖と有性生殖を経てライフサイクルを完了し、感染を広げます。

プロトコル

1. C. parvum Oocystsからのスポロゾイトのin vitro精製

1. 上記のように漂白剤を洗い流した後、C. parvum オーシストからスポロゾイトを精製します。
   1. オーシストを15mLのチューブに移します。オーシストを室温励起培地(0.75% w/v タウロコール酸ナトリウム in DMEM)に再懸濁して、1 x 10⁷ オーシスト/mL を得ます。タウロコール酸の添加は、オーシストの励起速度を改善し、スポロゾイトの収量を改善します。
   2. オーシスト懸濁液を37°Cで1〜1.5時間インキュベートします。
   3. サンプルを顕微鏡で観察し、スポロゾイトの良好な回収には60〜80%の励起が妥当です。排泄レベルが低い場合は、より長くインキュベートします(さらに30分から1時間)。
   4. 開始オーシストの数に対する放出率を決定します。排泄は次のように計算されます:
      % excystation = [1 – (無傷のオーシストの数/開始時のオーシストの数)] x 100
   5. 14 mLのPBSまたは培地を添加し、細胞(無傷のオーシスト、オーシスト殻、およびスポロゾイト)を3,400 x gで20分間遠心分離して回収し、スポロゾイトを回収して細胞を洗浄して励起試薬を除去します。細胞を失わないように慎重に吸引します。
   6. スポロゾイトペレットを 1 〜 2 mL の DMEM に再懸濁して、3 x 10⁷ オーシスト/mL を得ます(開始オーシストの数に基づく)。
   7. 残りのオーシストとシェルを除去するには、懸濁液を3μmフィルターでろ過します(図1B)。10 mLシリンジバレルにポリカーボネートフィルター(3 μmの細孔サイズ)を取り付けた47 mmフィルターホルダー装置を使用してください。フィルターホルダー装置を15mLチューブの上に置きます。アセンブリを氷のバケツまたは冷蔵室に置きます。
   8. 7.5 mLのスポロゾイト懸濁液をフィルターアセンブリに加え、重力でろ過します。さらに7.5mLのDMEM.
      で洗い流してください。 手記： スポロゾイトの単離を成功させるためには、新鮮なオーシストと良好な排泄が重要です。除去されていないオーシストが多すぎると、懸濁液は重力によって流れなくなります。シリンジに圧力をかけると、脱落したオーシストが強制的に通過する可能性があります。スポロゾイトのマイクロインジェクションは、スポロゾイトが凝集して毛細血管を塞ぐ可能性があるため、オーシストのマイクロインジェクションよりも困難です。これを避けるために、オルガノイドにスポロゾイトを注入する際には、毛細血管の先端を広くすることをお勧めします。十分な感染レベルを達成するためには、オーシストに感染したオルガノイドと比較して、各オルガノイドに2〜4倍の数のスポロゾイトを注入する必要があります。
   9. ろ過されたスポロゾイト懸濁液をスイングバケットローターを使用して3,400 x gで20分間遠心分離し、スポロゾイトをペレット化します。
   10. 0.05% (w/v) Fast Green 色素と L-グルタチオン、ベタイン、L-システイン、リノール酸、タウリン含有還元バッファー (材料表を参照) を添加した 50–100 μL の OME または OMD オルガノイド培地 (材料表を参照) に再懸濁します。
       手記：オーシストを長時間インキュベートすると、スポロゾイトが溶解し、回復が不十分になる可能性があるため、避けるべきです。

>2. マイクロインジェクションのためのヒト腸管の体外培養

1. 増殖および分化培地条件下での培養腸オルガノイド.
   注:腸内増殖の詳細については、以前に他の記事で説明されています(メディアレシピの材料表を参照)。ここでは、オルガノイド培養法について、クリプトスポリジウムの注入と増殖の最適化について具体的に言及しながら簡単に説明します。オルガノイド中の寄生虫のイメージングには、分化培地で増殖したオルガノイドよりも、分化培地で成長させたオルガノイドよりもデブリの蓄積が少ないことが分かりました。しかし、オーシストの単離が目的であれば、分化培地で成長させたオルガノイドは、はるかに多くのオーシストを生成します。
   1. 3D培養液中のオルガノイドを細胞外マトリックス(材料表参照)で37°Cに維持し、その上にOME(オルガノイド増殖培地)を添加し、毎日リフレッシュしてください。
   2. マイクロインジェクション用のオルガノイドを分割してプレート化するには、ヒトオルガノイドを含む6ウェルプレートから培地を取り出し、ウェルにF12+++(材料表を参照)を添加し、1 mLのピペットチップで数回ピペッティングしてマトリックスを分砕します。細胞を15 mLのチューブに集めます(チューブあたり2 mLのF12 +++で十分です)。
   3. 10〜12 mLのF12+++を別の15 mLチューブに加え、ファイヤーポリッシュガラスピペットを培地に入れ、ピペットを3回上下させてヒト腸オルガノイドを分解します
      手記：長いガラスピペット(20〜30 cm)を使用し、短時間火で磨きます。開口部(直径1 mm)はオルガノイドが損傷する可能性があるため、あまり小さくしないでください。ピペットの先端を軽く火で磨いて滑らかにします。オルガノイドを~50 μmの小さな断片に砕きます。
   4. F12+++を5〜7mLまで添加し、350 x gで5分間遠心分離します
      手記： このステップでの遠心分離速度は、細胞外マトリックスから十分に分離された良好な細胞ペレットを作るために、通常よりも高速です(材料の表を参照)。マウスの小腸オルガノイドと比較して、ヒトの小腸オルガノイドは破壊されにくいことが観察されています。
   5. 細胞を乱さずにできるだけ多くの培地を除去し、次いでマトリックスを4°Cに維持してペレットを再懸濁する;6ウェルプレートのウェルあたり200〜300μLのマトリックスが必要である。オルガノイドは、かなり高い細胞密度を維持するために、1つに3つに分割する必要があります。
   6. オルガノイドをそれぞれ約5〜10 μLのマトリックス液滴に6ウェルプレートのウェルにプレートします。37°Cで20〜30分間インキュベートし、その上に増殖培地(OME)を加えます。
   7. 2〜3日ごとに媒体を交換してください.
      手記：EMで成長したオルガノイドは、約5〜7日で100〜200μmのサイズに達し、注射の準備が整います。
   8. オルガノイドを分化するために、EMで5〜6日後、培地を分化培地(DM)条件に変更し、寄生虫を注入する前にさらに5〜6日間保持します><。 手記： オルガノイドの増殖には、オルガノイドを密にプレートすることをお勧めします。マイクロインジェクションには、オルガノイドを低密度でプレーティングした6ウェルプレートの使用が推奨されます。例えば、6ウェルプレートの3ウェルからマイクロインジェクション用のフル6ウェルプレートにオルガノイドをプレート化します。マトリックスは、長期保存のために-20°Cに維持し、使用前に4°Cまたは氷上で解凍する必要があります。

3. オルガノイド内腔へのオーシスト/スポロゾイトのマイクロインジェクション

1. 3Dオルガノイドの頂端側に寄生虫をマイクロインジェクションします(図2)。
   1. マイクロピペットプーラーを使用して直径1mmのガラスキャピラリーを準備します.
      手記：マイクロピペットプーラー(材料の表を参照)で使用される設定は、熱= 663、プル= 100、速度= 200、時間= 40ミリ秒です。設定は、特定のマシンのユーザーの指示に従って調整する必要があります。
   2. 鉗子で毛細血管の先端を切ります。毛細管端のサイズ/直径は約9〜12μmです。これにより、オーシスト(4〜5μmサイズ)の流れが容易になります。
   3. マイクロローダーチップを使用して、オーシストまたはスポロゾイト懸濁液でキャピラリーを充填します。
   4. オーシストを充填したキャピラリーをマイクロインジェクターにロードします。
   5. 倒立顕微鏡で100〜200 nLの懸濁液を各オルガノイドに5倍の倍率でマイクロインジェクションし、圧力を一定に保ちます。マイクロインジェクション後、毎日OMEまたはOMD(オルガノイド分化培地)で培地をリフレッシュし、プレートを37°Cに維持します
      手記： マイクロインジェクションにはマイクロマニピュレーターは使用しておりません。すべてのサンプルに均等に注入するために、実験全体で同じキャピラリーを使用することをお勧めします。

結果

図1:クリプトスポリジウムオーシストとスポロゾイトの調製と精製。 (A)感染のためのオーシストおよびスポロゾイト調製に用いた方法の概略図。(B)オーシストのin vitro排泄を示す画像。未抽出のオーシストと貝殻のろ過により、スポロゾイトの精製溶液が得られます。スケールバー = 10 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
基底膜抽出物(細胞外マトリックス)	アムスバイオ	〒3533-010-02
Dynamag 15ラック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12301Dの
Dynamag 2ラック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12321Dさん
EMDミリポアイソポアポリカーボネートメンブレンフィルター-3μm	EMD-ミリポア	TSTP02500
ファストグリーン染料	シグマ	F7252-5G
Femtojet 4i マイクロインジェクター	エッペンドルフ	5252000013
直径1mmのガラスキャピラリー	WPIの	TW100F-4
マトリゲル(細胞外マトリックス)	コーニング	356237
マイクロチューブ 1.5ml	エッペンドルフ	T9661-1000EA
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ	〒612-7933
マイクロピペットプーラー P-97	シャッター計器	P-97
ペンストレップ	ギブコ	15140-122
次亜塩素酸ナトリウム(5%を使用)	クロロックス	50371478
スーパースティックスライド	ウォーターボーン株式会社	S100-3
Swinnex-25 47mmポリカーボネートフィルターホルダー	EMD-ミリポア	SX0002500
タウロコール酸ナトリウム塩水和物	シグマ	T4009-5Gの
Tween-20 (トゥイーン 20	メルク	8221840500
ボルテックスジーニー2	サイエンティフィック・インダストリーズ(株	SI0236
Adv+++ (DMEM+ペンストレップ+グルタマックス+ヘプス)			最終金額
DMEM	インビトゲン	〒12634-010	500ミリリットル
ペンストレップ	ギブコ	15140-122	500ml DMEMに5mlのストック
グルタマックス	ギブコ	35050038	500ml DMEMに5mlのストック
ヘペス	ギブコ	15630056	500ml DMEMに5mlのストック
腸管オルガノイドMEDIA-OME(拡張培地)			最終濃度
A83-01	トクリス	2939-50ミリグラム	0.5μM
ADV+++			100mlまで作る
B27	インビトゲン	17504044	1倍
EGFの	ペプロテック	AF-100-15	50ng/mL
ガストリン	トクリス	3006-1mg	10 nM
ナック	シグマ	A9125-25Gの	1.25mM
NICの	シグマ	N0636-100Gの	10mM
ノギンCM	社内*		10%
P38阻害剤 (SB202190)	シグマ	S7076-25 mg	10μM
PGE2	トクリス	2296から10	10 nM
プリモシン	インビボジェン	アリ-PM-1	1ml/500ml のメディア
RSpoI コマーシャル	社内*		20%
Wnt3aのCM	社内*		50%
社内* - 細胞株はご要望に応じて提供されます
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD(分化培地)			オルガノイドを分化するために、増殖する小腸オルガノイドをWntリッチ培地で分裂後6〜7日間増殖させた後、分化培地で増殖させます(Wnt、ニコチンアミド、SB202190の回収)、分化培地での増殖(Wntリッチ培地またはOMEからのWnt、ニコチンアミド、SB202190、プロスタグランジンE2の回収)
還元緩衝液(オーシストおよびスポロゾイトの注射用再懸濁用)			最終濃度
L-グルタチオンの減少	シグマ	G4251-10MG	0.5 μg/μl の OME/OMD/LOM
ベタイン	シグマ	61962	0.5 μg/μl の OME/OMD/LOM
L-システイン	シグマ	168149から2.5G	0.5 μg/μl の OME/OMD/LOM
リノール酸	シグマ	L1376-10MG	6.8 μg/ml の OME/OMD/LOM
タウリン	シグマ	T0625-10MG	0.5 μg/μl の OME/OMD/LOM

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