$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 感染
- ハマダラカをPlasmodium berghei ANKAに感染させ、配偶子細胞マウスに15分間給餌します。感染した蚊を湿度80%、21°Cに保ちます。
- 血の食事の17〜22日後にケージからメスの蚊を集めます。それらを氷の上に置いて麻酔をかけます。
- 鉗子を使用して、冷たいRPMI培地を一滴垂らしたスライドガラスに3〜4匹の蚊を置きます。スライドを顕微鏡下に置きます。
- 鉗子を使用して、頭と体の間で蚊を慎重に伸ばします。注射器と針を使用して唾液腺を分離します。残りの蚊に対してこの手順を繰り返します。
- スライドガラスから唾液腺をガラスピペットで吸い上げ、1.5mLの遠心分離チューブに集めて採取します><。
手記：感染率にもよりますが、通常、唾液腺あたり8,000〜15,000の感染性スポロゾイトを取得できます。
- 約3分間、遠心分離チューブ内の分離された唾液腺を小さなプラスチック製のスティックで粉砕し、唾液腺組織からスポロゾイトを分離します。
- 1,000 x g、4°Cで3分間遠心分離し、残りの組織からスポロゾイトを精製します。
- スポロゾイト(SPZ)を含む上清を新しい遠心分離チューブにピペットで移し、ノイバウアー血球計算盤で精製されたスポロゾイトをカウントします。
- 精製したスポロゾイトの濃度を10,000/mLに調整するには、リン酸緩衝生理食塩水を加えます。
- 近交系C57BL/6マウスの尾静脈に合計1,000個のスポロゾイト(0.1mL)を注入し、感染を開始する。注射を容易にするために、C57BL/6マウスを拘束装置に置き、尾部を温水(約37°C)に入れて尾静脈の可視化を支援します
手記：注入自体は、数秒以内に実行できる短い手順です。
- 1日1回、SPZ感染後3日目以降、血液塗抹標本の血液段階の寄生虫症を確認します。
- スポロゾイト注射後5日目から、Rapid Murine Coma and Behavior Scale(RMCBS)スコアを使用してマウスを1日1回評価します。
- Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) スコアと対処すべき研究課題に従って、磁気共鳴画像法 (MRI) イメージングでマウスを評価します。