ヒト気管支肺胞洗浄液からのマクロファージにおける細胞外トラップの可視化

要約

出典: Sharma, R. et al., Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、気管支肺胞洗浄液からの気管支肺胞マクロファージにおけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)の免疫標識と、共焦点顕微鏡を使用したそれらの視覚化を示しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 気管支肺胞洗浄(BAL)マクロファージ

1. BALを使用して、(1)気管支鏡検査によるヒト被験者、および(2)気管内吸引を使用してマウスの肺マクロファージを取得します><。 手記：マクロファージの獲得は、一般にこれらの細胞の何らかの活性化を引き起こす。マクロファージは、潜在的な医学的問題を調査するために気管支鏡検査が必要な患者から取得され、すべての被験者がマクロファージ細胞外トラップ、またはMETSの分析に適しているわけではありません(これは個々のプロジェクトごとに決定する必要があります)。
   1. BAL溶液をスピンダウン(500 x gで10分間)してペレット状にし、室温で培地(Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI)5%ウシ胎児血清と1%L-グルタミンを含む)で2回洗浄し、4mLの培地で細胞を希釈します。
   2. 必要であれば、正式な差分カウントを要求してください;ほとんどの細胞(一般的に>80%)はマクロファージになります。
      手記：これは通常、さまざまな細胞タイプの形態学的外観を使用して臨床組織学サービスによって実行されます。
   3. トリパンブルー排除と血球計算盤を使用して、BAL溶液で生存マクロファージ細胞数を実行します.
      手記：BAL溶液は、ステップ1.1で述べたように、ヒトおよびマウスから得られます。
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   4. ウェルあたり500 μLの培養培地でカバースリップ上の24ウェルプレートに1 - 4 x 10⁵マクロファージを加え、37°Cで一晩放置すると、細胞がカバースリップに接着します。ヒトサンプルの場合は、抗生物質(ペニシリンやストレプトマイシンなど、10⁴ U/mL)を添加して、細菌汚染を防ぎます。

>2. BALマクロファージの免疫蛍光標識/顕微鏡法

>注:セルは上記のようにカバースリップに接着されます。

1. 培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄します。細胞を2%パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸塩/リジン(PLP)固定液で10分間固定します。
2. 細胞をPBSで短時間洗浄した後、PBSで0.2%Tween 20で20分間透過処理します。
3. PBSで30分間希釈した5%ウシ血清アルブミン(BSA)中の10%ニワトリ血清で細胞をブロックします。
4. 一次対照抗体およびアイソタイプコントロール抗体と室温、1:100の濃度で1時間インキュベートします(より具体的な詳細は材料の表に記載されています)、37°C.
   手記：BALサンプルの場合、通常、マクロファージの特定のマーカーは必要ありません。
5. 一次抗体を添加した後、細胞をPBSで洗浄し、さらに対応する二次抗体と室温で40分間インキュベートします。
6. 切片をPBSで洗浄し、DAPIベースの封入剤でマウントし、レーザー励起405、488、561、および647 nmで共焦点顕微鏡(前述)を使用して視覚化し、40倍、1.0 NAのオイル対物レンズで観察します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト検体:一次抗体
ウサギ反ヒトH3Cit(シトルリンR26)	アブカム	AB5103	10 UG / ミリリットル
マウス反ヒトMMP9	ノーバスバイオロジカル	AB119906	1:200腹水、集中力なし
ウサギ反ヒトPADI2/PAD2	アブカム	AB16478	7μg/ミリリットル
マウス対ヒトPADI4/PAD4	アブカム	AB128086	10.1 UG / ミリリットル
二次抗体
チキンアンチラビットAF 488 /	ライフテクノロジー	A-21441
チキンアンチウサギAF 594	ライフテクノロジー	A-21442
チキンアンチヤギAF 594	ライフテクノロジー	A-21468
チキンアンチマウスAF488	ライフテクノロジー	A-21200
ソフトウェアプログラム
イマリス	ビットプレーン
画像J	NIHの
蛍光色素の強度を平均化するには、Microsoft Excelなどの標準的なオフィスアプリケーションを使用できます
顕微鏡
C1共焦点走査型顕微鏡	ニコン
FV1200 共焦点走査型顕微鏡	オリンポス
モナッシュメディカルセンターの気管支鏡検査室からのヒトBALサンプル
メディア
RPMI(ルプミ)	シグマ・アルドリッチ	R8758
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	F0926
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G7513
その他の試薬
パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸塩/リジン(PLP)固定剤	シグマ・アルドリッチ	27387
天然ホルマリン	シグマ・アルドリッチ	42904
カバースリップ12 ml	シグマ・アルドリッチ	S1815
カバースリップ60 x 24 ml	シグマ・アルドリッチ	C6875