イネ葉の真菌感染を確定するための噴霧接種技術

要約

出典:Zhang, M., et al.植物感染試験:植物病原体Magnaporthe griseaのスプレーおよび創傷媒介接種。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、イネの葉に病原菌Magnaporthe grisea感染を確立する技術を示しています。真菌性分生子懸濁液をイネの葉の一部に噴霧し、壊死性病変の形成を採点することで疾患の進行を評価します。

プロトコル

1. M. grisea Conidiaの懸濁液による噴霧接

種

1. M.griseaの菌類培養
   1. 真菌株用のオートミールトマト寒天(OTA)培地を準備します。
   2. オートミール30〜50gを秤量し、これを800mLの蒸留/脱イオン水(ddH₂O)に加え、電気ポットで30分間煮沸します。
   3. 茹でたオートミールジュースをガーゼを通してビーカーにろ過します。
   4. ビーカーの濾液にトマトジュース150mLと寒天20gを加え、_ddH2Oを最大1,000mLまで加えます。
2. 実験材料の準備
   1. イネ(Oryza sativa)品種Lijiangxintuan-heigu(LTH)の約50種子をddH₂Oに3日間浸すか、大麦(Hordeum vulgare cv Golden Promise)の約50個の種子をddH₂Oに約1日間浸します。
   2. 米や大麦の種を湿らせたガーゼで包み、直径10cm×10cm、28°Cのシャーレ約30枚で湿らせた濾紙で発芽させます。イネの種子の発芽時間は約2〜3日、大麦の種子の発芽時間は約2日です。温室内の相対湿度は約70%です。
   3. オートクレーブ処理された培養土と水やりを使用して、米または大麦の苗を鉢に植え、次にバーミキュライトの層でそれらを覆います。
   4. 植物を25°Cの適切な温室または成長キャビネットに約1~2週間置きます。
   5. 滅菌手術用ハサミ(各円の直径は8 cmである必要があります)で濾紙を3層円形に切り取り、100 mmの滅菌プラスチックプレートに置きます。
   6. 各皿に_ddH2Oを加えて、ろ紙を浸します。
   7. 濾紙が完全に濡れていることを確認してくださいが、余分な水は加えないでください。
   8. 余分な水分は真空ポンプで取り除きます。
   9. 無菌のつまようじ2本を培養皿に入れて、米/大麦の葉を支え、つまようじを~2〜3cm離します。
   10. 種を蒔いてから2週間後に米の葉を集めるか、種を蒔いてから7日後に大麦の葉を取ります。
   11. 4枚から6枚の葉の稲・大麦の苗で、茎の下部を上から~5cmのところに切り取り、葉を採取します。
3. スプレー接種プロトコル
   1. OTAプレート上の真菌株をサーモスタットインキュベーター(25°C)で~4日間培養します。
   2. 0.5 - 5 mL のピペットを使用して、各 4 日齢プレートに ~2 mL の ddH₂O を加えます。
   3. 接種ループで、M. grisea野生型株の菌糸体と突然変異株を菌糸体の破片にこすり落とします。
   4. 菌糸体の破片を収集し、新しいOTAプレートに移します。菌糸体の破片を取り、クリーンベンチでブロードライします。
   5. プレートを3層のガーゼで覆い、日中25°C(14時間)、夜間23°C(10時間)の温室で分生子の成長に必要な湿度を24〜48時間
   確保します。
   6. 各皿に2mLのddH₂Oを加え、滅菌綿棒で分生子をやさしくこすり落とし、続いて2層のレンズペーパーでろ過します。培地の表面を傷つけないように注意してください。
   7. 分生子懸濁液を100〜1,000 μLのピペットで新しい50 mLチューブに移します。
   8. 25°Cで5,000 x g以上で5分間遠心分離します。
   9. 上清を取り除き、ペレットを再懸濁して、0.025%(v / v)Tween-20溶液中に1mLあたり2 x 10⁴分生子を与えます。Tween-20溶液は通常約10〜20mLです。
   10. 胞子懸濁液をハンドヘルド噴霧器に注ぎます。
   生後
   11. 2週間のイネの苗のイネの葉または生後7日のオオムギの苗のオオムギの葉に約10mLの針分懸濁液を散布し、暗くて湿度の高いチャンバーで25°Cで~24時間インキュベートします。
   12. 葉を25°Cの蛍光灯の下で12時間の光周期で別の湿ったチャンバーに移します。
   13. 接種後5日目に病気の症状を記録します。長さ~6cmの米/大麦の葉の病気を調べます。評価基準は、国際稲研究所(IRRI)のいもち病耐性のスコアリングシステムに準拠しています。耐爆性に関するスコアリングシステムの詳細を表1に示します。
   14. 葉を撮影して、テストした株の感染を評価します。感染は、3.6 cm²あたりの病変数によって評価されました。

>表1:耐爆性のためのスコアリングシステム。 この表は、International Rice Research Institute(IRRI)から引用されています。

名 名 します

規模	形容
1	ピンポイントサイズの小さな茶色の斑点
2	直径約1〜2 mmの小さな丸みを帯びたからわずかに細長い壊死性の灰色の斑点があり、はっきりとした茶色の縁があります。病変は主に上部の葉に見られます
3	病変の種類は2と同じですが、上の葉にかなりの数の病変があります
4	典型的な感受性いちょう病変、3 mm 以上、葉面積の 4% 未満に感染する
5	典型的な感受性いちょう病変、3 mm以上、葉面積の4〜10%未満に感染する
6	典型的な感受性芽球病変、3 mm以上、葉面積の11〜25%未満に感染する
7	典型的な感受性い芽球病変、3 mm以上、葉面積の26〜50%未満に感染する
8	典型的な感受性いもち病巣、3mm以上、葉面積の51-75%未満に感染し、多くの葉が枯れています
9	典型的な感受性いちょう病変(3 mm以上)は、葉の面積の75%以上に感染

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	AOBOX Biotechnology(中国)	01-023
濾紙	GE Healthcareブランド(スウェーデン)	10311387
50mLチューブ	コーニング(アメルシア)	430290
遠心機	エッペンドルフ(アメリカ)	5804Rの
Tween-20 (トゥイーン 20	クーレーバー(中国)	CT11551-100ミリリットル
カルチャーディッシュ	サーモフィッシャー(アメリカ)	150326
0.5-5 mLピペット	エッペンドルフ	4920000105
100-1000uLピペット	エッペンドルフ	4920000083
真空ポンプ	ライボルト	D25Bの
孵卵器	MEMMERT(メンメルト	PYX313
接種リング	グライナーバイオワン	731175

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