創傷による真菌接種によるイネ葉感染の確立

要約

出典:Zhang, M. et al., 植物感染試験:植物病原体Magnaporthe Griseaの噴霧および創傷媒介接種。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、Magnaporthe grisea myceliumの創傷接種によるイネの葉の感染の確立を示しています。真菌の胞子由来の生殖管が表皮層を貫通し、組織感染や葉の損傷を引き起こします。この方法は、病原型のスクリーニングを支援し、分子育種のための植物抵抗性の理解を深めます。

プロトコル

1. M.griseaの菌類培養

1. 真菌株用のオートミールトマト寒天(OTA)培地を準備します。
2. オートミール30〜50gを秤量し、これを800mLの蒸留/脱イオン水(ddH₂O)に加え、電気ポットで30分間煮沸します。
3. 茹でたオートミールジュースをガーゼを通してビーカーにろ過します。
4. ビーカーの濾液にトマトジュース150mLと寒天20gを加え、_ddH2Oを最大1,000mLまで加えます。

2. 実験材料の準備

1. イネ(Oryza sativa)品種Lijiangxintuan-heigu(LTH)の約50種子をddH₂Oに3日間浸すか、大麦(Hordeum vulgare cv Golden Promise)の約50個の種子をddH₂Oに約1日間浸します。
2. 米や大麦の種を湿らせたガーゼで包み、直径10cm×10cm、28°Cのシャーレ約30枚で湿らせた濾紙で発芽させます。イネの種子の発芽時間は約2〜3日、大麦の種子の発芽時間は約2日です。温室内の相対湿度は約70%です。
3. オートクレーブ処理された培養土と水やりを使用して、米または大麦の苗を鉢に植え、次にバーミキュライトの層でそれらを覆います。
4. 植物を25°Cの適切な温室または成長キャビネットに約1~2週間置きます。
5. 滅菌手術用ハサミ(各円の直径は8 cmである必要があります)で濾紙を3層円形に切り取り、100 mmの滅菌プラスチックプレートに置きます。
6. 各皿に_ddH2Oを加えて、ろ紙を浸します。
7. 濾紙が完全に濡れていることを確認してくださいが、余分な水は加えないでください。
8. 余分な水分は真空ポンプで取り除きます。
9. 無菌のつまようじ2本を培養皿に入れて、米/大麦の葉を支え、つまようじを~2〜3cm離します。
10. 種を蒔いてから2週間後に米の葉を集めるか、種を蒔いてから7日後に大麦の葉を取ります。
11. 4枚から6枚の葉の稲・大麦の苗で、茎の下部を上から~5cmのところに切り取り、葉を採取します。

>3. 菌糸体キューブまたは分生子懸濁液の液滴による創傷接

種

1. 解剖学的な針を使用して、分離した米/大麦の葉の主静脈にある長さ2〜3cmの傷を3つこすり落とします。
2. 削った葉をつまようじに置き、0.02%(v / v)Tween-20溶液を葉にスプレーして液滴の層を形成します。
3. OTAプレートからM. grisea株(野生型、変異株、補体株、またはその他の試験株)ごとに0.5 cm x 0.5 cmの菌糸体プラグを切断します。
4. 菌糸体プラグまたは分生子懸濁液の25μL液滴を傷ついた葉に置き、葉を25°Cで湿ったチャンバーで3〜8日間インキュベートします。
5. 接種後5〜7日で病変を検査します。検査方法はスプレー接種法と同じです(ステップ1.3.13参照)。
6. 長さ~6cmの罹患米・大麦の刃を検査し、写真を撮って試験菌株の感染を評価します。感染は、3.6 cm²あたりの病変数によって評価されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
寒天	AOBOX Biotechnology(中国)	01-023
濾紙	GE Healthcareブランド(スウェーデン)	10311387
Tween-20 (トゥイーン 20	クーレーバー(中国)	CT11551-100ミリリットル
カルチャーディッシュ	サーモフィッシャー(アメリカ)	150326
真空ポンプ	ライボルト	D25Bの
解剖針	FSTの	26000-35
孵卵器	MEMMERT(メンメルト	PYX313

) )