ウイルス感染検出のためのin vitro組換えウイルスレポーターシステム

要約

出典:Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、組換えHBVレポーターシステムを介してB型肝炎ウイルス(HBV)感染を検出するin vitro技術を示しています。宿主細胞に感染すると、組換えウイルスゲノムはルシフェラーゼレポーター酵素を発現し、その基質を酸化すると生物発光を産生し、ウイルス感染の検出に役立ちます。

プロトコル

1. レポータータンパク質をコードする組換えHBVの作製

1. HepG2細胞の調製
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、および100 U/ml非必須アミノ酸を添加した細胞培養培地(ダルベッコ改変イーグル培地またはDMEM)を調製します。
   2. トランスフェクションの前日に、10 cmコラーゲンコーティング皿に4 x 10⁶個のHepG2細胞を10 mLの培養培地でプレートします。HepG2細胞を加湿した5%_CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします><。 手記：約4 x 10⁶ HepG2細胞を10 cmコラーゲンコーティング皿10 mLの培養液中にプレーティングすると、翌日には70〜90%がコンフルエントになります。
2. トランスフェクション
   1. メーカーの指示に従って、トランスフェクション試薬を使用して、5 μgのpUC1.2HBV(B型肝炎ウイルス)デルタイプシロンと5 μgのpUC1.2HBV/NL15でHepG2細胞をトランスフェクションします。
   2. 翌日、培地を取り出し、新鮮な培地10mlを加えます。
   3. トランスフェクションの1週間後、組換えHBVを含む培地を50 mLチューブに移し、ステップ1.3.1に進みます。トランスフェクションした細胞が入ったプレートに10 mLの新鮮な培地を加えます
      手記： 組換えHBVの産生は4週間維持されます。組換えHBVを含む培地は、4°Cで1ヶ月間保存できます。
3. 組換えHBVの精製
   1. 組換えHBVを含む培地から細胞破片を遠心分離(2,300 x gで5分間)により除去します。
   2. 上清を0.45μmのメンブレンフィルターに通します。
   3. 組換えHBVを含有する培地に等量の26% PEG/1.5 M NaCl(ポリエチレングリコール6000:130 g、NaCl、49 g、1 ml、0.5 M EDTA(エチレンジアミン四酢酸)pH 8.0、1 M HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(pH 7.6 in 500 ml)5 mlを等量加え、穏やかに混合します。4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 2,300 x gで4°Cで20分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、ペレットを0.5 mLのTNE(10 mM Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、50 mM NaCl、1 mM EDTA)に溶解します。
   6. 2,300 x gで5分間遠心分離することにより、破片を除去します。
   7. 組換えHBVを含むTNE0.5 mLをTNE中の20%スクロース0.8 mLにロードします。
   8. 100,000 × gで15°Cで3時間遠心分離します。
   9. 上清をできるだけ多く捨て、ペレットを保存します。開始培地40 mLあたり1 mLの無血清DMEMに再懸濁します。
   10. 4°Cで一晩インキュベートします。
   11. 0.45μmフィルターでろ過します。0.5mlのアリコートを調製し、-80°Cで保存します
       手記：元のウイルスサンプルのレポータータンパク質汚染が観察された場合は、TNE中の5-30%スクロースを100,000 x gで2時間密度勾配超遠心分離するか、1.1-1.6 g/mL、150,000 x gで50時間CsCl密度平衡遠心分離してウイルスを精製します。

2. 組換えHBVの感染

1. HBV感染にかかりやすいNTCP(タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド)(HepG2/NTCP)を安定して発現するHepG2細胞をDMEMで培養し、加湿した5%_CO2インキュベーターで10%FBS、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、250μg/mlのG-418(ジェネチシン)、および100U/mlの非必須アミノ酸を37°Cで補充します。
2. 感染の1日前に、約5 x 10⁴ HepG2/NTCP細胞を0.1 mLの培養培地で96ウェルコラーゲンコーティングプレートにプレートします。
3. 組換えHBVを37°Cのウォーターバスで、バイアルに氷が少し残るまで解凍します。
4. 96ウェルプレートのウェルあたり、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に40%PEG8000 10μl、ジメチルスルホキシド(DMSO)2μl、組換えHBV10μl、および78μlの新鮮培地を組み合わせて、感染用の培地を準備します。
5. 100 μlの組換えHBV溶液を96ウェルプレートの1ウェルに添加します。
6. 感染の1日後、感染した細胞をウェルあたり300μLのPBSで3回洗浄し、ウイルス画分から汚染されたレポータータンパク質を除去します。
7. 感染した細胞を2% DMSOを含む培養液200 μlで1週間以内インキュベートします。

3. 分析

1. 感染後1週間後、感染した細胞をPBSで3回洗浄します。
2. 50 μlの溶解バッファーを感染細胞に加えます。
3. 培養プレートを5分間揺さぶった後、2,000 x gで5分間遠心分離します。
4. レポーター基質50μlをルミノメータープレートに加えます。
5. レポーター基質を含むルミノメータープレートに20 μlの細胞ライセートを加えます。短時間ボルテックスして混ぜます。
6. プレートをルミノメーターに置き、読み取りを開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nano-Glo ルシフェラーゼアッセイ リージェント	プロメガ	N1110
ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液	ナカライ・テスク	09367-34
MEM非必須アミノ酸溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140050
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11995065
Opti-MEM I 還元型血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31985070
100mm/コラーゲンコーティングディッシュ	いわき	4020-010
リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3000001
ポリエチレングリコール(PEG)6000	シグマ・アルドリッチ	81255
ポリエチレングリコール(PEG)8000	シグマ・アルドリッチ	89510
NaCl	ナカライ・テスク	31319から45
0.5 mol/l-EDTA溶液	ナカライ・テスク	06894から14
トリス-HCl	ナカライ・テスク	35434から21
Millex-HP、0.45 μm、ポリエチレンスルホン、フィルター	メルクミリポア	SLHP033RS
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D2650
コラーゲンコーティングされた96ウェルプレート	コーニング	NO3585
パッシブ溶解 5xBuffer	プロメガ	E1941
GloMax 96 マイクロプレートルミノメーター	プロメガ	E6501
蔗糖	ナカライ・テスク	30403から55
ルミノメータープレート	グライナーバイオワン	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBVデルタイプシロン	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. Cancer. Sci. (2015)
50mlチューブ	ビオラモ	1-3500-02
抗Myc抗体	シグマ・アルドリッチ	C3956
HBIGの	一般社団法人 日本血液製剤機構	-
IFN-β	持田製薬	1.49872E+13
ヘパリン	シグマ・アルドリッチ	H3393-J

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