実験化合物を投与するための成体ゼブラフィッシュの経口挿管

要約

出典:Ji, J., Thwaite, R. et al. 成魚の経口挿管:生理活性化合物の腸内摂取を評価するためのモデル。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、成魚のゼブラフィッシュに経口挿管して実験化合物を食道に投与し、腸内への取り込みを監視する技術を示しています。この方法は、腸内の経口予防薬やその他の化合物の動態を研究するための貴重なモデルを提供します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています

1. 必要な解決策

1. ゼブラフィッシュが飼育されている水槽から、3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸(MS-222)溶液を150 mg / L(麻酔用)または300 mg / L(安楽死用)調製します。小さなタンクに1Lの麻酔薬溶液を入れ、通気しておきます。
2. 魚の回収のためにMS-1を含まない222Lの水槽水で別の小さなタンクを満たし、それを通気したままにします。
3. 10x滅菌ストック溶液から50mLの1x PBSを調製します。
4. サイトメトリー分析/腸管細胞単離には、ストック溶液または1% v/vペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の粉末から、魚1匹あたり1 mLの新鮮な0.15%コラゲナーゼIV型溶液を十分に調製します(資料を参照)。2mLの遠心分離チューブに1mLのアリコート(魚1匹につき1本)を作ります。解剖ステップの30分前まで4°Cに保ちます。
5. 共焦点顕微鏡法/サンプル固定には、PBS中の新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液50 mLを調製するか、ドラフト内の-20°C冷凍庫からストック溶液を解凍します><。 注意： PFAは有毒です。作業する前に、製品安全データシートをお読みください。手袋と安全メガネを着用し、常にフュームフード内に溶液を置いておく必要があります。

2. 経口挿管のための機器の準備

1. 約1cmの細いシリコンチューブを31Gのルアーロック針に置き、針先を覆います。
2. 10 μLの滅菌フィルターピペットチップ(約2 cm)をカットし、細い方の端を取り、シリコンチューブをシースとして上に置きます。動物を傷つけないように、ピペットが針の先端を超えて伸びていることを確認してください。
3. 針を100 μLルアーロックシリンジに取り付けます.
   手記：常にエタノールですすいでから、治療の合間にリン酸緩衝生理食塩水(PBS、材料を参照)で十分にすすいでください。

3. 蛍光ナノ粒子懸濁液の調製

1. タンパク質ナノ粒子をAtto-488 NHSエステル(材料表を参照)または製造元の指示に従って適切な蛍光色素で標識します。
2. ナノ粒子を0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液に2 mg/mLの濃度で再懸濁します。
3. Atto 488 NHSエステルをアミンフリーのジメチルスルホキシド(DMSO)に2 mg / mLで溶解します。.10μLのアリコートを保管して、ラベリング効率を確認してください。
4. ナノ粒子とAtto 488 NHSエステルをモル比1:2(タンパク質:色素)で暗所で攪拌して混合します。
5. 標識したナノ粒子を8,000 x gで室温で10分間遠心分離してスピンダウンし、上清を除去して保持し、標識効率を確認します。
6. 標識したナノ粒子を1 mLの0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、ボルテックスおよびピペッティングで上下させて洗浄します。その後、上清を8,000 x gで遠心分離し、室温で10分間廃棄します。手順3.6を5回繰り返します。
7. ペレットを15 mLの遠心チューブ内の5 mLの0.1 M重炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、1.5 mLの遠心分離チューブ(30アリコート)で蛍光ナノ粒子のアリコートを作製します。8,000 x gで室温で10分間スピンダウンし、上清を捨て、光から保護して-80°Cで保存します。

4.ゼブラフィッシュの麻酔と経口挿管

1. 実験の少なくとも48時間前に魚(>0.5 g)を絶食して腸を空にします。
2. 魚(12匹)を実験水槽(6L)に一晩前に移動して、順応を可能にする12。
3. ナノ粒子溶液ウェル(例:2,500 rpmおよび30 s)をボルテックスし、所望の量のナノ粒子懸濁液(例:20〜50 μL)を保護針に取り付けられたシリンジに吸い上げます。
4. 魚を曝気された150 mg/L MS-222溶液(セクション1参照)に、水槽の底に沈み、尾びれのピンチに反応しなくなるまで入れます。このプロセスは5分未満で完了します。
5. 麻酔をかけた魚をネットで濡れたプラスチックトレイにすばやく移し、動物を針に向ける水平に向け、すぐに経口挿管を開始します。
6. 片手で魚を丁寧に支え、もう一方の手で保護された針を使って口を開けます。針を食道にそっと挿入し、口口から約1cmまで
   手記：オペレーターは、ピペットチップの端がえらを通過したときにわずかな抵抗を感じる場合があります。針の入り口を傾けすぎてエラに穴が開かないように注意してください。
7. ナノ粒子懸濁液をゆっくりと魚に注入します。懸濁液がえらや口を通って外側に流れないように注意してください。
8. 針をそっと取り外し、魚を回収タンクに入れます(セクション1を参照)。通常、回復には1分かかります。
9. 魚に異常がないか注意深くチェックしてください(たとえば、えらからの出血は穿孔の兆候です)。
10. 魚が回復したら、実験水槽に戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シリコンチューブ	ダウコーニング	〒508-001	内径0.30mm、外径0.64mm
ルアーロックニードル	ハミルトン	7750-22	31 G、Kel-Fハブ
ルアーロックシリンジ	ハミルトン	81020年01月	100 μL、Kel-Fハブ
フィルター付きピペットチップ	ネルベプラス	07-613-8300	10 μL
MS-222	シグマ・アルドリッチ	E10521	粉
10倍PBS	シグマ・アルドリッチ	P5493
濾紙	フィルターラボ	RM14034252
Atto-488 NHSエステル	シグマ・アルドリッチ	41698
DMEM	ギブコ	31966	ダルベッコの修正イーグルミディアム
Maxwell RSC simplyRNA 組織キット	プロメガ	AS1340

(代表) 型 の 年