免疫適格げっ歯類モデルにおける肺炎連鎖球菌の気管支内点滴

要約

出典: Hoover, J. L., et al., A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、免疫適格なげっ歯類モデルで、挿管と肺葉への細菌懸濁液の設置による肺感染の確立を示しています。このモデルにより、免疫適格動物での抗菌効果試験が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物に麻酔をかけ、挿管し、接種

する

>注:体重100〜120 gの特定の病原体を含まない(SPF)免疫適格な雄のSprague-Dawleyラットが推奨されます。すべての動物に餌と水を自由に提供し、標準的な12時間の明暗サイクルで木材チップやその他の吸収性寝具に社会的に収容します。

1. 実験を行う前に、動物種に適したサイズの金属カニューレとポリエチレンチューブを入手して滅菌してください。滅菌済みの1mLの使い捨て注射器と滅菌済みの使い捨て25ゲージ針を入手してください
   注意： これらの注射器と針は、常に鋭利物容器に廃棄してください。
   1. ラットの場合は、長さ約12 cm、内径0.9 - 1.0 mm、外径1.0 - 1.2 mmで、一端が約45°の角度に曲げられた金属製のカニューレを購入または製造します。長さ 11 〜 12 インチのポリエチレン チューブを ID 0.4 mm、外径 0.8 mm で切断します (図 1A を参照)。
   2. 金属製のカニューレをガラス、スクリューキャップチューブ、オートクレーブに標準的な方法で入れて滅菌します。ポリエチレンチューブのカットした長さを、アルコールの入ったカバー付きビーカーに浸して保管します。
2. 作業面と挿管装置を準備します。
   1. 清潔な使い捨てマットを作業面のウォーターバスの近くに置きます。ガラス製の収納チューブに入った金属製のカニューレをこの表面に移します。保管チューブからキャップを取り外し、カニューレの「ハンドル」端をチューブの開放端にスライドさせます。
   2. 滅菌鉗子を使用して、ビーカーからポリエチレンチューブの1つを取り外し、滅菌金属カニューレの内側に挿入して、自由に動くことを確認します。滅菌済みの使い捨て25ゲージ針(ラット用)をポリエチレンチューブの自由端に取り付け、針をチューブに数mmスライドさせます。(ラットについては図1Aを参照)。
   3. 金属製のカニューレとポリエチレンチューブの両方にガイドマークを配置し、安楽死させた1匹の動物に以下で説明する挿管手順に従って、動物への挿入の深さを示します。観察のために胸腔を開き、金属製のカニューレを適切に配置し、ポリエチレンチューブを適切に進めます。消えないペンを使用して、金属製のカニューレが動物の口と接する場所に印を付け、ポリエチレンチューブが金属製のカニューレの上部と接する場所に印を付けて、残りの動物に適切に配置されるのを助けます。
3. ヒュームフード内で(または適切な清掃システムを使用して)、ギャグ反射が抑制されるまで(約1分)><1.5 L /分の酸素中に≤5%イソフルランが供給された密閉チャンバー内で一度に最大6匹の動物を麻酔します 手記：実験を行う前に、使用されている特定の条件下でのイソフルランの安全な用量と曝露時間を確立してください(例:. チャンバーのサイズ/タイプ、動物のサイズ/種/株)不注意による致死的な曝露を防ぐため。
4. 滅菌使い捨て1 mLシリンジ(ラット用)に滅菌生理食塩水を入れ、滅菌チップを生理食塩水に入れ、プランジャーに引き戻します。.ポリエチレンチューブに取り付けた針にシリンジを取り付け、シリンジが空になるまでチューブを通して生理食塩水の全量を洗い流します。.
5. シリンジに水浴中の容器からの寒天ベースの接種物を入れ、チューブがプライミングされるまで(たとえば、寒天で完全に満たされるまで)チューブを通して寒天を洗い流します。
   1. ラットの場合は、使い捨て注射器から25ゲージの針(ポリエチレンチューブに取り付けられている)を取り外します。.使用済みのシリンジは鋭利物容器に廃棄します。新しい滅菌使い捨て1 mLシリンジに、滅菌チップを接種物に入れ、プランジャーを引き戻して、ウォーターバス内の容器から寒天ベースの接種物を入れます。針(ポリエチレンチューブに取り付け)を再度取り付け、チューブが寒天で完全に満たされるまでプランジャーを押し下げて、チューブを通して寒天を洗い流します。
6. 麻酔室から1匹の動物を取り出します。図1Cに示すように、動物を使い捨てマットの上で仰臥位にし、頭を右に、尾を左に置きます。
7. 挿管装置(すなわち、ポリエチレンチューブが取り付けられた金属カニューレ)を使用して、動物を挿管し、カニューレを左肺の大きな葉に挿入します(図1Dを参照)。
   1. 金属製のカニューレの自由端を動物の口に挿入します。自由端が上向きに角度がつくようにカニューレを回し、わずかにねじる動きで喉頭構造を慎重に迂回しながら、カニューレを気管内にゆっくりと進めます。図1Cに示すように、左人差し指で気管リングを触診しながら、カニューレをわずかに前後に数回ゆっくりとスライドさせることにより、食道ではなく気管への挿入を確認します。
   2. カニューレが気管が左右の気管支に分かれる分岐部に到達したら、動物の左側に向かってわずかにねじる動きをして、カニューレが左気管支に挿入されるようにします。金属製のカニューレを、端が左肺の半分から4分の3まで下がるまで進め、前に配置したガイドマークを使用して適切な深さに達したことを確認します。
   3. 金属製のカニューレを所定の位置に設置した状態で、ポリエチレンチューブを数mm進めます。チューブに以前に配置されたガイドマークを使用して、金属製のカニューレの端から出るのに十分な距離だけ前進させ、肺に穴を開けないようにします。
8. 両方のカニューレを所定の位置に配置した状態で、付属のシリンジを使用して、寒天懸濁液の100μL(ラット用)を左肺の大葉の奥深くに注入します(図1Dを参照)。ポリエチレンチューブを数mm引き抜いてから、無傷の挿管デバイスを静かに取り外します。.それをガラス製の収納チューブに戻し、動物を新しいケージに移して回復させます。

結果

図1:非外科的気管内挿管。ラット(A)とマウス(B)に挿管するためのツールが示されています。麻酔をかけたら、動物はCに示すように配置され、技術を実行する個人が右利きの場合は頭を右に、尾を左にする必要があります。左手の人差し指を喉にそっと置き、気管リングを触診してカニューレの正しい配置を確認します。接種物は、ラットの肺の腹側図に示されているように、左肺の奥深くに配置する必要があります(D)。サンプルの段階希釈およびプレーティング後に寒天上で成長するコロニーは、Eで示されたものと同様に見えるはずです。図1D、Copyright © Gill Smith [Laboratory Animals, Vo...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガイドツール	インテックサービス株式会社	GT01
1 mL TBシリンジスリップチップ	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	309659
プレシジョングライドニードル 25G x 5/8	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	305122
イントラメディックポリエチレンチューブ	クレイ・アダムス・ブランド - ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー	427401	マウス用プラスチックカニューレ
動物給餌針-ストレート20 x 3 "2-1 / 4	ポッパー・アンド・サンズ社	7903	マウス用の金属カニューレを作成するために使用されます
75 TN 5.0 μL シリンジ 26s/2"/2	ハミルトン	87930	HPLCガラス注入シリンジ
Difco Nutrient Agar(ディフコ ニュートリエント寒天培	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	213000
パイレックスチューブ、ラバーライン付き25x150スクリューキャップを培養	コーニング	9825から25	金属製カニューレのオートクレーブ/保管
プレシジョングライドニードル 25G x 5/8	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	305122
70%イソプロピルアルコール	ヴィジョン(白鳥)	NDCの0869-0810-43
イソフルラン、USP	ピラマルヘルスケア	NDCの66794-013-10
50 mLポリプロピレンコニカルチューブ30 x 115 mm	Falcon、コーニングブランド	352070
75 TN 5.0 μL シリンジ 26s/2"/2	ハミルトン	87930	HPLCガラス注入シリンジ