免疫病理学研究のためのラットモデルにおける十二指腸内カニューレ挿入術

要約

出典:Trevaskis, N. L. et al., 腸間膜リンパ管カニューレ付きラットモデル:腸管リンパ薬物輸送の評価への応用。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、ラットモデルでの十二指腸内カニューレ挿入を示しています。ラットに麻酔をかけた後、十二指腸が特定され、小さな穿刺が作成されます。先端が斜めになったJ字型のカニューレを丁寧に挿入して固定し、切開部を閉じます。カニューレ付きラットモデルは、免疫病理学研究のための腸内注入を可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術前日の準備

1. 必要に応じて、手術の前夜にラットを絶食します。ネズミが水に自由にアクセスできることを確認してください。
2. ラットに投与する溶液を準備します。
   1. 滅菌生理食塩水やリンゲルス溶液などの再水和液を準備します。
   2. 必要に応じて麻酔液を準備します。ここで説明した実験で使用した麻酔薬は、ケタミン100 mg/ml1.9 ml、キシラジン100 mg/ml0.5 ml、アセプロマジン10 mg/ml0.2 ml、生理食塩水2.5 mlを組み合わせた「カクテル1」と、ケタミン100 mg/ml1 mlとアセプロマジン0.1 ml10 mg/mlを1.9 ml組み合わせた「カクテル1」で構成されていました。吸入イソフルランまたはセボフルランは、長期間にわたって麻酔の外科的面を提供できるため、好ましい場合があります。.
3. 滅菌水に10 mg / mlのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む抗凝固剤溶液を調製するか、生理食塩水に10 IU / mlヘパリンを含有してリンパカニューレを洗い流します。.また、食塩水に2.5〜10 IU / mlのヘパリンを含む抗凝固液を準備して、頸動脈カニューレを洗い流します。.
4. 十二指腸(外径0.96 mm、内径0.58 mm)に挿入するためのポリエチレンカニューレを準備します。
   1. カニューレを必要な長さ(通常、十二指腸カニューレの場合は25〜30 cm)に切断し、滅菌外科用ブレード(図1を参照)を使用してカニューレの先端にベベルを配置します
      手記：これにより、カニューレの挿入が容易になり、挿入後のカニューレ閉塞の発生率が低下します。
   2. カニューレの小さな部分をループさせて、カニューレをそれ自体に戻し、ライタープレートまたはホットプレートで加熱してから、サイズに合わせてカットすることにより、J字型のアンカーポイントを十二指腸内カニューレに配置します(図1を参照)。
5. リンパカニューレを25Gの針と抗凝固剤溶液(ステップ1.3で調製)が入ったシリンジに取り付けます。リンパカニューレに抗凝固剤溶液を充填し、溶液をカニューレに一晩(O / N)放置して、リンパ採取中のリンパカニューレの血栓形成の発生を減らします。
6. リンパ液と血液サンプルを採取するためのチューブを準備します。リンパ採取チューブを事前に計量し、リンパ液および血液サンプル採取用のチューブにラベルを付け、抗凝固剤溶液を追加します。十分な抗凝固剤溶液を添加して、滅菌水中の1 mg / mlエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、または採取したリンパ液または血液中のヘパリン10 - 20 IU / mlの最終濃度を達成します。.

2. 手術開始直前の準備

1. カニューレを滅菌生理食塩水または抗凝固液で洗い流して、カニューレが特許を取得していることを確認してください。
2. 外科的処置のためにラットを準備します。
   1. 手術およびサンプル収集期間中、ラットに麻酔をかけます。
      1. たとえば、25 G の針に取り付けられた 1 ml の注射器を使用して、ラットの首の後ろの皮膚のひだに 1.5 ml/kg のカクテル I (ステップ 1.2.2 から) を皮下注射して麻酔を開始します。必要に応じて、25 Gの針に取り付けられた1 mlの注射器を使用して、0.44 ml / kgのカクテル2(ステップ1.2.2から)の腹腔内注射により麻酔を維持します。.
      2. 手術を開始する前に、呼吸数、ひげの動き、筋肉の緊張、足のつまみなどの刺激に対する反応を観察して、麻酔の深さが十分であることを確認してください。必要に応じて追加の麻酔を投与します。
   2. 十二指腸カニューレ挿入のために、腹部の右側を含む手術領域から毛皮を剃ります。
   3. ポビドンヨード溶液またはクロルヘキシジン溶液と70%エタノールスクラブを使用して、手術部位を無菌的に洗浄します。これを各領域について3回繰り返し、70%エタノールで最終洗浄します。
3. 動物を背側に横たわらせ、加熱した手術用パッド(37°C)の上の清潔なシートに置きます。

3. 十二指腸のカニューレ挿入

1. 動物を右側をオペレーターに向けて置きます。必要に応じて、手術用顕微鏡の助けを借りずに手術を行います。
2. 腹部筋壁の最上層を、正中線(剣状突起)から胸郭(肋骨縁)の約2cm下の右側まで伸びる直線的な4cmの切開で開きます(図2Bを参照)。
3. 腹筋壁の残りの層を、小さな手術用ハサミを使用して、正中線から右側4〜5mmの外側から右側まで開きます(図2Bを参照)。
4. 小腸を左腹筋壁の下に引っ込め、通常の生理食塩水で飽和した滅菌ガーゼ2〜3枚を使用して所定の位置に保ちます。
5. 十二指腸カニューレを、再水和液で満たされた注射器(例:.、10 ml)に取り付けます。
6. 十二指腸を小腸の明るいピンク色(より多くの血管を持つ)の部分として識別し、穏やかに下向きに引っ張ると胃が現れます。
7. 滅菌済みの23G針を使用して、胃と十二指腸(幽門)の接合部から約2cm下の十二指腸に小さな穴を開けます。
8. 十二指腸カニューレのJ字型のフックエンドを穿刺穴に挿入します。シアノアクリレート接着剤を一滴垂らして所定の位置に固定します。
9. 輸液ポンプに装填された再水和シリンジにカニューレを取り付けて、ラットの水分補給を開始します。文献によると、水分補給速度は0.5〜3 ml /時の範囲です。
10. リンパ液と十二指腸のカニューレ挿入が完了したら、腹筋壁の切開部を縫合糸で閉じます。次に、切開部の側面に沿って組織接着剤(シアノアクリレート)を数滴塗布し、切開部の両側の皮膚を一緒につまんで、皮膚の切開部を閉じます。

結果

図 1. 頸動脈またはリンパカニューレの斜めの先端の形状と、十二指腸カニューレのJ字型の斜めの先端の形状を図式

化。

図 2.(A)リンパ管をカニューレ状にする準備のために腹部を剃ったところ、(B)正中線から右脇腹に向かってまっすぐに伸びる4cmの切開部で開いた腹筋壁をリンパ管に通じているところ、(C)右腎臓に垂直な上腸間膜リンパ管(黄色の丸部分)の写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
滅菌生理食塩水	バクスターヘルスケア	AHB 1307	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、バクスター100ml生理食塩水バッグ、50個入りの箱です
水に70%エタノール	任意		どんなブランドでも使えます
グルコン酸クロルヘキシジン溶液(Microshield 4)	リビングストン・インターナショナル	JJ60243L	どのブランドでも使用できます http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
ベタジン溶液	リビングストン・インターナショナル	BU0510	どのブランドでも使用できます http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
イリウムケタミル(ケタミン100mg / ml)	プロベットビクトリア	ケータI.1	http://www.provet.com.au/
腸骨キシラジル(キシラジン100 mg / ml)	プロベットビクトリア	トロ-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10注射(アセプロマジン10 mg / ml)	プロベットビクトリア	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
ヘパリン(35000I.U.35mL中)	シグマ・ファーマシューティカル	337220	http://sigmaco.com.au/
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物	シグマ・アルドリッチ	E1644	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、シグマのEDTAの二ナトリウム塩です。
ポリエチレン(PE)カニューレ 外径 0.96 mm x 内径 0.58 mm	マイクロチューブエクステンション	PE8050	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、PEチューブ0.8x0.5 mm、30 mです
ポリエチレン(PE)カニューレ ød. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm	マイクロチューブエクステンション	PE9658	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、PEチューブ0.96x0.58 mm、30 mです
ルーラー	任意		どんなブランドでも使えます
マーカー	任意		どんなブランドでも使えます
シガーライター	任意		どんなブランドでも使えます
シアノアクリレート接着剤	任意		どんなブランドでも使えます
23ゲージ針	リビングストン・インターナショナル	DN23GX0.75LV	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、リビングストンの使い捨て針、滅菌、23GX0.75インチ、100 / BOXです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN23GX0.75LV
25ゲージ針	リビングストン・インターナショナル	DN25GX1.0LV	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、リビングストンの使い捨て針、滅菌、25GX1.0インチ、100 / BOXです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN25GX1.0LV
1mlシリンジ	リビングストン・インターナショナル	T3SS01TA	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、テルモシリンジ1mlスリップツベルクリン100/ボックスです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=T3SS01TA
10mlシリンジ	リビングストン・インターナショナル	T3SS10SA	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、テルモシリンジ10mlスリップ100/ボックスです。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=T3SS10SA
ガーゼ綿棒	リビングストン・インターナショナル	GSC075	どのブランドでも使用でき、必要なサイズにカットできます。ここでの例は、綿を7.5x7.5 cm、8プライで充填したガーゼ綿棒です。http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=GSC075
ヒーティングパッド	ラテック	WT1	温度を37°Cに保つブランドなら何でも使用できます。ここでの例は、Ratekの保温トレイです。
無影灯	ハーバード大学装置	72-0215 と 72-0267	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、ハーバードの装置V-Lux 1000冷光源と二股グースネックライトガイド、黒、繊維径4.7mm(各アーム)です。http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
手術用顕微鏡	ツァイス	495005-0014-000	どのブランドでも使用できます。例えば、Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C、Stand S Double Spot、KL 300 LEDなどです。https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
シルク縫合糸	リビングストン・インターナショナル	DTSK163019F4	どのブランドでも使用できます。ここでの例は * このアイテムを友人にメールで送信 3/8 サークル リバース カット シルク縫合糸 3/0 スレッド 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=DTSK163019F4
メスの刃	ファインサイエンスツール(FST)	10020-00	どのブランドでも使用できます。ここでの例はFSTメスブレード#20です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
メスのハンドル	ファインサイエンスツール(FST)	10004-13	どのブランドでも使用できます。ここでの例はFSTメスハンドル#4です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1x小型手術用ハサミ	ファインサイエンスツール(FST)	14060から09	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、FSTファインハサミ、9 cm、刃先21 mm、シャープ、ストレートです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
鋸歯状の湾曲した先端を持つ2x鉗子	ファインサイエンスツール(FST)	11001-13	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、湾曲した2.8x1.4mmの先端を持つFST 13cm標準パターン鉗子です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
2x止血剤	ファインサイエンスツール(FST)	13010-12	どのブランドでも使用できます。すべてのオペレーターが止血剤を使用するわけではありません。ここでの例は、長さ20 mm x 幅1.3 mmの鋸歯状のストレートチップを備えたFST 12 cmマイクロモスキート止血剤です。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1x縫合糸ニードルホルダー	ファインサイエンスツール(FST)	12001年13	どのブランドでも使用できます。ここでの例は、長さ16mm×幅1.9mmの先端を持つFST 13cm Hasleyニードルホルダーです。http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70

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