胸膜播種性肺癌のマウスモデルの確立

要約

出典:安井、H.、他 胸膜播種マウスモデルのための近赤外光免疫療法。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、免疫不全マウスの胸腔に肺がん細胞懸濁液を注入することにより、胸膜播種のマウスモデルを生成する方法を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 胸膜播種モデルの生成

1. ルシフェラーゼ発現標的細胞を調製し、100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
   中に1.0 × 10⁶の標的細胞を懸濁します 手記：肺がんやMPMなどの胸腔内がん細胞が標的細胞として適しています。ルシフェラーゼ発現細胞をルシフェラーゼ遺伝子トランスフェクションにより作製し、>10細胞継代後にルシフェラーゼの高発現を確認しました。細胞は、10%ウシ胎児血清ペニシリン(100 IU/mL)およびストレプトマイシン(100 mg/mL)を添加した培地で培養しました。細胞数は、腫瘍の増殖速度と治療の経時経過に応じて調整した(1.0.×10 5-6.0 ×^{10 6}細胞/体重)。
2. 8〜12週齢の雌ホモ接合体裾野裸マウスを準備し、好ましい体重は19〜21 gです。
3. イソフルランによる処置中にマウスに麻酔をかけ(導入:4-5%、維持2-3%);ピンセットで尾を押して反応がないことを確認します。
4. 発泡スチロールでストッパーを作り、30Gの針にストッパーを取り付けて先端が5mmのままになるようにすることで、肺の損傷を防ぎます。気胸を避けるために、清潔な鉗子で針先を曲げるか、70%EtOHで洗浄された硬い物体に針先を押し付けて曲げます(図1).
   注意：自分に穴を開けないように注意してください。鉗子を使用して針を曲げます。針に取り付けるときは、ストッパーを持たないでください。細胞をシリンジに充填する前にストッパーを貼り付ける方が安全です。
5. シリンジ(1mL)に標的細胞を充填し、ストッパー付きの30G針を取り付けます。
6. 処置の前に動物の胸部を70%EtOHで消毒してください。
7. 肋間腔を通してマウスの胸部に針を突き刺します。その際、肋骨に当たった際の抵抗により、針先が上下に動いてしまいました。肋間腔を通過した後、シリンジをマウスに押し付け、100μLの標的細胞を注入します(図2).
   手記：針が胸腔に適切に入ると、マウスは深く呼吸します。針先を曲げることで、気胸や肺への不適切な細胞注入を避けることができた
   手記： 心臓壁穿刺のリスクを避けるために、右胸壁穿刺が推奨されます。
8. マウスを2〜3回転がして、細胞を胸腔全体に広げます。
9. マウスを清潔で暖かいケージに戻し、歩行可能になるまで監視します。処置後、マウスは麻酔から目覚め、正常に動作します。

結果

図1:細胞移植のための簡単な手作りのデバイス。発泡スチロール製のストッパーを30Gの針に取り付けて、先端が5mmのままになるようにします。気胸を避けるために、針の先端を曲げる必要があります。

図2:胸腔への標的細胞の注入。マウスを横に向け、針をマウスに突き刺し、肺に向けて突き刺します。ストッパーと針先が曲がっているため、針が肺にくっつかずに胸腔に入ります。針をマウスに押し付けながら、標的細胞を注入します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mLシリンジ	テルモ	SS-01T(ティー)	マウス実験用
30Gの針	ニプロ	1907613	マウス実験用
BALB/cSlc-ニュー/ニュー	日本SLC
D-ルシフェリン(カリウム塩)	ケイマンケミカル	14681	生物発光イメージングおよびDLIT
イソフルラン	和光	095-06573	マウス用麻酔
0.25w/v% トリプシン -1mmol/l EDTA 4Na 溶液、フェノールレッド	和光	〒209-016941	細胞培養用
RPMI-1640 と L-グルタミンとフェノールレッド	和光	〒189-02025	細胞培養用