ラットに慢性実験的自己免疫性ドライアイを誘発する技術

要約

出典:Hou, A., et al. A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、ラットに慢性的な実験的自己免疫性ドライアイ疾患を誘発する技術を示しています。自己抗原および外来抗原を含む抗原アジュバントエマルジョンを所定の間隔でラットに注射すると、同じ抗原を眼表面組織に注入することにより、免疫ラットに慢性眼の炎症が誘発されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 涙腺エキスの調製

>注:ラットは、ケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔されました。つま先つまみと尻尾つまみにより、適切な麻酔が確認されました。眼科用ジェルをラットの眼に塗布して、各処置後の乾燥を防いだ。麻酔をかけたラットは、動物が完全に回復するまで暖かく保つために遠赤外線の下に置かれました。処置と回復期間中、動物は研究者によって綿密に監視されました。すべての材料と手術器具は、使用前に滅菌されていました。実験終了時に、ラットにペントバルビタール(80mg/kg)の腹腔内注射により安楽死させた。完全な安楽死は、心臓の脈拍の欠如と眼球に触れることによるまばたき反射がないことによって確認されました。ラットは標準条件で飼育されました:室温、21-23°C;相対湿度、30-70%;明暗サイクル、交互に12時間(午前7時から午後7時)。

1. 安楽死させた雌のSprague-Dawleyラット(8週から16週の範囲)を平らに置き、片方の耳をテーブルに当て、もう片方の耳を上に向けて置きます。露出した耳の下にスプリングハサミで10mmの上下に切開を行います。涙腺を周囲の結合組織と排液管から解剖して取り除きます。
   1. 必要になるまで、グランドを-80°Cで保管します。氷の上で腺を解凍します。はさみで氷の上でできるだけ細かくミンチします。涙腺あたり150 μLのPBSと1xプロテアーゼ阻害剤を添加します。
2. ソニケーターを10秒オンに、10秒オフに30%の振幅でオフに設定して、氷上で20分間サンプルを超音波処理します。超音波処理したサンプルを13,000 x gおよび4°Cで20分間遠心分離します。
3. 上清をピペットで移し、新しいチューブに移します。上清を1.5 mLチューブに分注し、-80°Cで保存し、製造元の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイでタンパク質濃度を測定します。

2. エマルジョンと百日咳毒素の調製

1. 乳剤
   1. 1 mg/mL 結核菌 H37Ra を含む 10 mL の完全フロイントアジュバントに 40 mg の熱死結核菌 H37Ra を加え、よく混ぜます
      手記：最終的な完全なフロイントのアジュバントには、5 mg/mL 結核菌 H37Raが含まれています。
   2. オボアルブミンを秤量し、PBSに溶解し、2 mg/mLのオボアルブミンと10 mg/mLの涙腺抽出物を含む抗原混合物を調製します。1動物あたり200μLの注入量を目標に、動物数をもとにマスターミックスを調製します。
   3. 不完全なフロイントのアジュバントまたは完全なフロイントのアジュバントを50 mLのチューブに移し、抗原混合物に対するアジュバントの量が1:1の比率になるようにします。抗原混合物をアジュバントに一滴ずつ添加し、こぼれないように最高速度でボルテックスします。すべての抗原が添加された後、5分間ボルテックスを続けます。
   4. エマルジョンを5 mLシリンジに移し、シリンジコネクタを介して別の5 mLシリンジとリンクします。.エマルジョンを一方のシリンジからもう一方のシリンジに押して混合します.
      手記：エマルジョンは、水に入れたときに単一の液滴が球として残る場合、準備ができています。調製したばかりのエマルジョンまたは4°Cで一晩保存したエマルジョンのみを使用してください。
2. 百日咳毒素
   1. 50 μgの百日咳毒素を500 μLの水に再構成して、最終濃度を100 ng /μLにします。容器を30秒間Votexして、毒素が完全に溶解することを確認します。
      手記： ろ過による滅菌は、材料の損失につながるため、行わないでください。凍結しないでください。この溶液は、4°Cで少なくとも6か月間活性を維持します。
   2. PBSを使用して、百日咳毒素100 ng /μLを3 ng /μLに希釈します。.希釈した百日咳毒素100μLを、27G針付きの1mLルアーロック注射シリンジに移します。.

3. ルイスラットの予防接種

1. 0日目に、エマルジョンを数回混ぜます。1 mgの涙腺抽出物と200 μgのオボアルブミンを完全なフロイントアジュバントに含んだ200 μLのエマルジョンを、27 G針を備えた1 mLルアーロックシリンジに分配します。.麻酔なしでラットの尾の付け根にエマルジョンを皮下注射します.
   手記： 注入前にテールを事前に温める必要はありません。各ラットは、1 mgの涙腺抽出物と200 μgのオボアルブミンを完全フロイントアジュバントに500 μgの結核菌H37Raで免疫します。
2. 14日目に、0日目と同じ方法で、不完全なフロイントアジュバントに1mgの涙腺抽出物と200μgのオボアルブミンを含むエマルジョン200μLを注入します。同じ日にラットあたり腹腔内麻酔でPBSの100μLに300 ngの百日咳毒素を注射します。.

4. 抗原混合物を小脳結膜下および涙腺に注入し、抗原特異的免疫細胞を動員して局所炎症を引き起こす

1. 実験に参加したラットの数に基づいて、オボアルブミンと涙腺抽出物の量を計算します。必要量のオボアルブミンを秤量し、ステップ1で調製した解凍した涙腺抽出物と混合して、1 mg/mLのオボアルブミンと1 mg/mLの涙腺抽出物を含む抗原溶液を作製します。
2. 腹腔内注射により、ラットにケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)で麻酔をかけます。.ラットのつま先をつまんで、適切な麻酔が達成されたことを確認します(つまり、つまんだ後、反応する動きは観察されません)。5 μL の抗原を眼の円蓋結膜に注入します。20 μLの抗原を涙腺に注入します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ・アルドリッチ	P2714-1BTLの
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーマルサイエンティフィック	23227
結核菌H37Ra	ベクトン、ディキンソン、そして会社	231141
フロイントのアジュバントを完成させる	ベクトン、ディキンソン、そして会社	231131
オボアルブミン	シグマ・アルドリッチ	A5503-10Gの
不完全なフロイントのアジュバント	シグマ・アルドリッチ	F5506-6×10ML
百日咳毒素	シグマ・アルドリッチ	P7208-50UGの
フルオレセインナトリウム溶液	ボシュロム U.K.リミテッド	NAの
備品
ソニケーター	ソニックス	バイブレーションセル
マイクロIV顕微鏡	フェニックス研究所	NAの