自己免疫性ドライアイラットモデルにおける角膜と涙液の滑らかさの評価

要約

出典:Hou, A. et al., 眼球組織中のエフェクターメモリーT細胞の増加を伴う慢性自己免疫性ドライアイラットモデル。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、自己免疫ラットモデルにおける角膜の滑らかさと涙液膜の安定性を評価する方法を示しています。これは、ドライアイ疾患を理解するために重要な、腺機能障害が涙液膜の安定性に与える影響を強調しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 涙腺エキスの調製

>注:ラットは、ケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔されました。つま先つまみと尻尾つまみにより、適切な麻酔が確認されました。眼科用ジェルをラットの眼に塗布して、各処置後の乾燥を防いだ。麻酔をかけたラットは、動物が完全に回復するまで暖かく保つために遠赤外線の下に置かれました。処置と回復期間中、動物は研究者によって綿密に監視されました。すべての材料と手術器具は、使用前に滅菌されていました。実験終了時に、ラットにペントバルビタール(80mg/kg)の腹腔内注射により安楽死させた。完全な安楽死は、心臓の脈拍の欠如と眼球に触れることによるまばたき反射がないことによって確認されました。ラットは標準条件で飼育されました:室温、21-23°C;相対湿度、30-70%;明暗サイクル、交互に12時間(午前7時から午後7時)。

1. 安楽死させた雌のSprague-Dawleyラット(8週から16週の範囲)を平らに置き、片方の耳をテーブルに当て、もう片方の耳を上に向けて置きます。露出した耳の下にスプリングハサミで10mmの上下に切開を行います。涙腺を周囲の結合組織と排液管から解剖して取り除きます。
   1. 必要になるまで、グランドを-80°Cで保管します。氷の上で腺を解凍します。はさみで氷の上でできるだけ細かくミンチします。150 μLのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSと1xプロテアーゼ阻害剤を涙腺あたりに加えます。
2. ソニケーターを10秒オンに、10秒オフに30%の振幅でオフに設定して、氷上で20分間サンプルを超音波処理します。超音波処理したサンプルを13,000 x gおよび4°Cで20分間遠心分離します。
3. 上清をピペットで移し、新しいチューブに移します。上清を1.5 mLチューブに分注し、-80°Cで保存し、製造元の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイでタンパク質濃度を測定します。

2. エマルジョンと百日咳毒素の調製

1. 乳剤
   1. 1 mg/mL 結核菌 H37Ra を含む 10 mL のフロイントアジュバント 10 mL に、加熱死した結核菌 H37Ra 40 mg を加え、よく混ぜます。
      手記：最終的な完全なフロイントのアジュバントには、5 mg/mL 結核菌 H37Raが含まれています。
   2. オボアルブミンを秤量し、PBSに溶解し、2 mg/mLのオボアルブミンと10 mg/mLの涙腺抽出物を含む抗原混合物を調製します。1動物あたり200μLの注入量を目標に、動物数をもとにマスターミックスを調製します。
   3. 不完全なフロイントのアジュバントまたは完全なフロイントのアジュバントを50 mLのチューブに移し、抗原混合物に対するアジュバントの量が1:1の比率になるようにします。抗原混合物をアジュバントに一滴ずつ添加し、こぼれないように最高速度でボルテックスします。すべての抗原が添加された後、5分間ボルテックスを続けます。
   4. エマルジョンを5 mLシリンジに移し、シリンジコネクタを介して別の5 mLシリンジとリンクします。.エマルジョンを一方のシリンジからもう一方のシリンジに押して混合します。
      手記：エマルジョンは、水に入れたときに単一の液滴が球として残る場合、準備ができています。調製したばかりのエマルジョンまたは4°Cで一晩保存したエマルジョンのみを使用してください。
2. 百日咳毒素
   1. 50 μgの百日咳毒素を500 μLの水に再構成して、最終濃度を100 ng /μLにします。容器を30秒間Votexして、毒素が完全に溶解することを確認します。
      手記：ろ過による滅菌は、材料の損失につながるため、行わないでください。凍結しないでください。この溶液は、4°Cで少なくとも6か月間活性を維持します。
   2. PBSを使用して、百日咳毒素100 ng /μLを3 ng /μLに希釈します。.希釈した百日咳毒素100μLを、27G針付きの1mLルアーロック注射シリンジに移します。.

3. ルイスラットの予防接種

1. 0日目に、エマルジョンを数回混ぜます。1 mgの涙腺抽出物と200 μgのオボアルブミンを完全なフロイントアジュバントに含んだ200 μLのエマルジョンを、27 G針を備えた1 mLルアーロックシリンジに分配します。.麻酔なしでラットの尾の付け根にエマルジョンを皮下注射します.
   手記：注入前にテールを事前に温める必要はありません。各ラットは、1 mgの涙腺抽出物と200 μgのオボアルブミンを完全フロイントアジュバントに500 μgの結核菌H37Raで免疫します。
2. 14日目に、0日目と同じ方法で、不完全なフロイントアジュバントに1mgの涙腺抽出物と200μgのオボアルブミンを含むエマルジョン200μLを注入します。同じ日にラットあたり腹腔内麻酔でPBSの100μLに300 ngの百日咳毒素を注射します。.

4. 抗原混合物を小脳結膜下および涙腺に注入し、抗原特異的免疫細胞を動員して局所炎症を引き起こす

1. 実験に参加したラットの数に基づいて、オボアルブミンと涙腺抽出物の量を計算します。必要量のオボアルブミンを秤量し、ステップ1で調製した解凍した涙腺抽出物と混合して、1 mg/mLのオボアルブミンと1 mg/mLの涙腺抽出物を含む抗原溶液を作製します。
2. 腹腔内注射により、ラットにケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)で麻酔をかけます。.ラットのつま先をつまんで、適切な麻酔が達成されたことを確認します(つまり、つまんだ後、反応する動きは観察されません)。5 μL の抗原を眼の円蓋結膜に注入します。20 μLの抗原を涙腺に注入します。

5. ドライアイの特徴の評価

>注:麻酔をかけたラットは、動きを避けるために、手袋をはめた手で平らな面に直立した位置で優しく保持する必要があります。

1. フェノールレッドスレッドで涙量を測定します。
   1. 1組の鉗子を使用して糸を保持し、もう1組の鉗子を使用してラットの下まぶたを引っ張ります。糸を下部円蓋の近位角に1分間置いてから、糸を取り外してください。
      手記：裂け目は糸の濡れた部分を赤くします。
   2. ミリメートルのマーキングが付いた定規の横にある糸の濡れた部分の長さを撮影します。画像ソフトウェア(ImageJなど)を使用して、濡れた長さを10分の1ミリメートルまで測定します。
2. 角膜/涙の滑らかさを測定します。
   1. ラットをリングイルミネーターとカメラを備えた実体顕微鏡の下に置きます。ラットの角膜に5μLの生理食塩水を適用します。手袋をはめた指で上まぶたと下まぶたを~5回動かして受動的にまばたきをし、生理食塩水を広げます。
   2. リングイルミネーターを角膜表面の中央に1.6倍の倍率で合わせます。10秒後に写真画像を取得する
      手記：リングイルミネーターは、動物の角膜に2列の円形のドット画像を投影します。歪みのないドットの規則的な間隔は、滑らかな角膜/涙液層を示唆しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ・アルドリッチ	P2714-1BTLの
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーマルサイエンティフィック	23227
結核菌H37Ra	ベクトン、ディキンソン、そして会社	231141
フロイントのアジュバントを完成させる	ベクトン、ディキンソン、そして会社	231131
オボアルブミン	シグマ・アルドリッチ	A5503-10Gの
不完全なフロイントのアジュバント	シグマ・アルドリッチ	F5506-6×10ML
百日咳毒素	シグマ・アルドリッチ	P7208-50UGの
備品
ソニケーター	ソニックス	バイブレーションセル
リングライトイルミネーターとカメラ付き実体顕微鏡	カールツァイス	NAの