に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

サマリー

リステリア菌は、マウスの細胞内細菌に対する免疫応答と遺伝的感受性を研究するためのモデル生物です。このメソッドは、細菌の負荷を測定し、 リステリア感染による免疫細胞の変化を決定するためにFACS解析forマウスからの肝臓と脾臓の単細胞懸濁液を生成するものを可能にします。

要約

リステリア菌は、（リステリア）グラム陽性通性細胞内病原体は¹です。マウスの研究では、通常、全身感染症²の結果リステリアの静脈内注射を、採用しています。注入後、リステリアはすぐに^CD8α+樹状細胞とクッパー細胞^3,4による取り込みのために脾臓や肝臓に発信しています。一度貪食、様々な細菌タンパク質は、ファゴソームから逃れるためにリステリアを有効細胞質ゾル内で生き残る、と⁵隣接する細胞に感染。感染の最初の3日間、別の生来の免疫細胞（例えば単球、好中球、NK細胞、樹状細胞） リステリアの増殖を抑える殺菌のメカニズムを媒介する。 CD8 ⁺ T細胞は、その後、通常は感染⁶の10日間以内に、募集し、ホストからのリステリアの最終的なクリアランスを担当しています。

感染マウスからのリステリアの成功クリアランスは、宿主の免疫応答⁶の適切な発現に依存する。近交系マウス系統^7,8の間で感度の広い範囲があります。一般に、 リステリア感染症にかかりやすくなることでマウスは抵抗性マウスに比べて増加細菌負荷および/ ​​または遅延クリアランスを示す、細菌の増殖を制御するために以下のことができます。連鎖解析とノックアウトマウス系統を含む遺伝学的研究は、配列の変化がリステリア感染^6,8-14する宿主応答に影響を与えるための種々の遺伝子を同定した。異なるマウス系統間に感染動態の定量と比較すると、したがって、 リステリア菌に対する免疫応答に寄与する宿主遺伝要因を同定するための重要な方法です。別のリステリア菌に対する宿主応答の比較はまた、抗生物質療法やワクチンの設計のための潜在的なターゲットとして働くことができる細菌の病原性因子を同定するための効果的な方法です。

ここでは、細菌負荷（コロニー形成単位[CFU]あたりの組織）を測定し、 リステリア感染マウスにおける免疫応答のFACS分析のために肝臓や脾臓の単細胞懸濁液を調製するための簡単な方法を説明します。このメソッドは、最初の小説のマウス系統におけるリステリア感染の特性だけでなく、 リステリアに感染した別のマウスの系統間の免疫応答の比較のために特に有用である。私たちは、 リステリア菌を使用し、血液寒天培地上で培養したときに、ひずみ¹⁵ EGDβ-溶血^1（図1）による各コロニーの周り特性ハローゾーンを示す。細菌負荷と免疫応答は、以下に記載されているプロトコルを使用してFACS解析のための血液寒天プレートと準備組織の細胞懸濁液での培養組織ホモジネートによる感染後の任意の時間の時点で決定することができます。我々は、免疫不全または妊娠している個人がリステリア菌処理ではないことに注意してだ、と仕事が始まる前に、関連する制度的なバイオセーフティ委員会及び動物施設の管理に相談する必要があります。

プロトコル

1。 リステリア菌の培養と長期保存（ リステリア菌 ）

1. 既製のウマ血液寒天培地（HBA）のプレートを作るか購入する。乾板は、事前℃で一晩または1時間層流キャビネット内で発見された配置で37プレインキュベートすることによって使用する。
2. 感染したマウスの組織ホモジネート、凍結乾燥株式、冷凍グリセロールストック、または最近のリステリア菌培養（継代培養10以上の世代の一週齢未満のとではないすなわち）からコロニー：次のいずれかから実行可能なリステリア菌を入手する。すべてのリステリアは、滅菌白金耳を使用して、このプロトコルで説明されているすべてのメソッドのために無菌技術を用いて取得する必要があります。
3. 一次接種の普及など、板の表面の¼以上リステリアストリーク：滅菌白金耳を用いて、図1に示すようにHBAのプレート上にリステリアストリーク。主なスプレッドから単方向の縞のシリーズを作る。ストリークの各セットの前に新鮮なまたは再滅菌ループを使用して2〜3回をストリーキング繰り返します。 37℃で一晩培養する。
4. 1ヶ月の最長期間は4℃でリステリア HBAプレートを保管したり、長期保存のためにリステリア文化を準備する1.5に進みます。
5. 滅菌白金耳を使用してHBAのプレートに、新鮮なリステリア菌培養液から単一コロニーを採取し、30 mLのマッカートニーのボトルでブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス（製造業者の指示に従って準備）10mLを接種する。
6. 37℃で一晩180rpmの軌道シェーカーでリステリア培養液を、。
7. 40％（v / v）の最終グリセロール濃度を得るために1:1の割合で液体リステリア文化に滅菌80％グリセロール（v / v）を追加します。 cryovialsに0.5〜1 mLのアリコートを移し、-70℃でリステリア /グリセロールストック℃にて保存してください。

ヒント＆ノート：

• リステリアの成長は、血液寒天の範囲（馬、羊、モルモットまたはヒト血液を補充）、ブレインハートインフュージョン（BHI）寒天または液体培地、または酵母でトリプシン大豆ブロスなど、さまざまな非選択培地上でサポートすることができます抽出液（TSB - YE）。成長を汚染することは定義されている抗生物質耐性（例えば、 リステリア菌 10403S）とリステリア菌用抗生物質を培地へ添加することにより、または選択的にリステリア菌の成長を支えるオックスフォードメディアを使用して、文化の中で最小にすることができる。
• リステリア菌は、テストされていないソースから取得される場合、それは追加のテストがリステリアの身元を確認するために行われることをお勧めします（ リステリア菌は、カタラーゼ陽性、非胞子形成、運動性<30 ° Cで、通性嫌気性、グラム陽性であり、オキシダーゼ陰性）。得られた培養はまた、純粋培養が得られることを保証するためにリステリア選択培地上で増殖することができます。
• HBAプレートの乾燥はプレート上の細菌コロニーの最適な分離が存在することを保証します。
• リステリアの凍結グリセロールストックを作成するときは、できるだけ少数の世代のために古いと継代培養1週間（<5が最高である）よりも小さい新鮮なHBA リステリア文化を使用してください。
• リステリア凍結グリセロールストックから得られるので、凍結グリセロールストックから、新鮮なリステリアの文化を派生させる場合には、最初の通路は直接液体培地で継代培養時に成長が悪い固体培地（すなわちHBAプレート）で行う必要があります。

2。 in vivoでの感染試験で用リステリア感染株の調製と貯蔵

1. としてステップ1.3で説明されているHBAのプレート上に凍結グリセロールストック（ステップ1.7）からリステリアストリーク。次の日に使用するために37℃で一晩培養する。
2. ストリークの培養液から単リステリアコロニーを採取し、10mLのBHIブロスに接種する。スープに寒天を転送することは避けてください。
3. ° C中期対数増殖期（OD600 =〜0.4）を180 rpmと37℃でオービタルシェーカーでリステリア BHIの培養液を、。これは通常3-4時間かかります。
4. 無菌的に0.9 mLずつを取り、揺れの3〜4時間で600 nmでのODの読みを取得する。 ODの読みは<0.3の場合は外径の測定値が約0.4になるまで、後、180 rpmでオービタルシェーカーで培養し、37 ° Cに進んでください。
5. 10mLのリステリア BHIブロス培養（OD600〜0.4）に1 mLの滅菌80％グリセロールを（V / V）を追加します。穏やかに混合し、0.5〜1 mLのアリコートで1.5mlマイクロチューブに移す。
6. -70℃で10分、店舗氷上でアリコートを置く℃に10 ⁹ CFU / mLの順になるのが普通な感染株におけるリステリアの濃度を、決定するために凍結されていないoneアリコートを残す。
7. unfroの1:10希釈系列を行います10 ^-8希釈にPBSで禅リステリア感染株。原液と、後続の各希釈液100μLにはガラススプレッダーを使用して重複で予備乾燥したHBAプレート（ステップ1.1）上に広げた。 37℃で一晩培養する。
8. 各プレートのコロニー数をカウントし、次の計算式を用いて凍結感染株式の文化のリステリア濃度を決定する。コロニーの濃度（CFU / mL）は=数×希釈率/ 0.1 mLの。カウント用に選択されたプレートが理想的に生菌のCFUの濃度の信頼性の高い推定値を確保するために30から300コロニーを持つ必要があります。
9. -70 リステリア感染の在庫を保管した後数日° C、つのチューブから解凍。ステップ2.7および2.8で説明したように実行可能なリステリアの濃度を決定する。この濃度は、ステップ2.8の新しく調製した感染株のために決定されたようになります。

ヒント＆ノート：

• リステリア感染株は、一般的な長期保存（40％）のために凍結リステリアのためのより低い割合のグリセロール（8％）で凍結されています。
• 冷凍リステリア感染株は、3ヶ月間、-70℃で一般的に安定しています。 3ヶ月を超えて使用する場合、それは新しい感染在庫がHBAのプレートに、新鮮なリステリア菌培養から調製されることをお勧めします。
• 解凍したリステリア感染株式の濃度（ステップ2.9）のような手順2.7および2.8に記載されて作りたての株式と異なる場合（CFUすなわち> 20％減）、その後、新しい凍結感染株を準備する必要があります。
• 単一の実験のために新鮮な細菌の接種を準備するよりも消費する初期段階から多少の時間は、凍結リステリア感染株を準備し、感染前とマウスは同じ凍結ストックから感染している実験の間のより良い一貫性へのCFUの濃度の正確な測定が可能になりますが。

3。 リステリア接種とマウスの静脈内注射の準備

1. マウスごとに注入するリステリアの濃度を決定する。静脈内注射の場合は、マウスあたり200μL接種のCFUが使用されます。
2. リステリア感染株の凍結一定分量を解凍する（ステップ2.6から）。希望のリステリア CFUの濃度にPBSで感染株式を希釈する。注射やリステリア CFUプレとポスト噴射（ステップ3.3と3.7）の決定のための接種材料が十分にあることを確認するためにすべてのマウスを注入するために必要なボリュームを倍増。
3. 準備リステリア接種から0.1 mLのアリコートを2倍と削除、およびマウスの注入前に各アリコートをPBSで1:10希釈液を準備する。プレート0.1 HBAのプレート上の各希釈液の添加、および37℃で一晩プレートをインキュベート℃にコロニーの数をカウントし、 リステリア菌接種の注射前の濃度を決定する：濃度（CFU / mL）を=（コロニーの数×希釈率）/ mLのは、その希釈率のためにプレーティング。
4. 清潔なケージに注入するマウスを移す。 5分（マウスまたは上昇40 ° Cにも使用することができる上記のケージの温度を燃やすことはありません他の適切な熱機器）のために〜50センチメートル250ワットの赤外線ランプの下にケージを置くことによってマウスを温める。尾静脈注射のための拘束装置にマウスを置きます。
5. ゆっくりと一貫性のあるサスペンションの注射器がロードされるたびに維持するためにリステリアサスペンションを混ぜる。
6. マウスの外側尾静脈を見つけ、静かに27ゲージの注射針と注射器を使用して、 リステリア菌接種（所望の濃度で）200μLをワイプして注入する70％エタノールで拭いてください。簡単に言うと滅菌ガーゼでエントリの傷口に圧力を適用する。そのケージにマウスを返します。
7. すべてのマウスの注入が完了すると、 リステリア菌接種の注射後の濃度を決定するために接種の残量を使用して、手順3.3を繰り返します。
8. マウスに注射リステリアの量は、プレとポスト噴射リステリア接種のサンプルから求めた平均CFUとして報告されます。

ヒント＆ノート：

• 抵抗性マウス系統（例えば、C57BL / 6）と感受性のマウス系統（例えば、BALB / cの間に細菌負荷と免疫応答を比較するとき - 3,000 CFU（15,000 CFU / mLの接種2500 CFU / mLの200μL - ）私たちは、典型的には500を注入する）。
• 感染株は少なくとも10を⁵でPBS中に希釈される場合には、洗浄工程は、一般的に残留メディア/グリセロールを除去する必要はありません。感染株は少なくとも10を⁵でPBS中に希釈されない場合には、洗浄工程は、以下のように残留メディア/グリセロールを除去するステップ3.2で追加する必要があります。4℃で10分間2100 × gで遠心分離によって収集された融解感染株と細菌へのDD 9mLをPBS℃に上清を除去し、10mLの滅菌PBS、繰り返しの遠心分離でペレット化細菌細胞を再懸濁し、そして目的のボリュームの細菌細胞ペレットを再懸濁します。としてステップ3.3と3.7で説明プリとポスト噴射リステリア接種のサンプルから平均CFUを決定します。それは、この洗浄ステップは、細菌の一部が失われる可能性があることに留意され、そしてそのような損失を事前に決定し、必要な濃度の接種を行う際に会計処理することをお勧めします。
• 安全にリステリアとマウスを注入した後、注射器と針を捨てる。

4。分析のためのリステリア感染マウスからの肝臓と脾臓の除去

1. CO ₂窒息などの地元の動物倫理委員会によって承認された方法を用いて所望の時点感染後に感染したマウスをEuthanase。
2. すぐに1 mLシリンジと25ゲージ針を用いて安楽死後に心臓のブリードを行ってください。できるだけ多くの血液を集める。胆嚢を削除し、下大静脈を切断する。
3. 絞りが配置されている肝臓が座っているように慎重に右に腸をプッシュすることで肝門脈を露出、頭に向かって、左に肝葉を反転。肝門脈は右下側から肝臓の底部に供給されます。
4. 26ゲージの針を用いて肝門脈に10 mLのPBSを注入して肝臓を灌流。門脈から注入PBSは、切断された下大静脈から終了します。肝臓の血流は、採取された細胞は、肝臓ではなく、循環血液中からのものであることを保証します。
5. マウスの体腔、FACSバッファ内の場所、そして氷の上でストアから灌流肝臓を削除します。 FACS解析のための肝臓の調製のために5.1を進みます。
6. マウス、FACSバッファ内の場所、そして氷の上でストアから脾臓を削除します。
7. 半分にカット全体の脾臓を、重さ、そして半分のいずれかを量る。 FACS緩衝液に半分を配置および6.1に進んでください。氷上でストマッカー袋に残りの半分を置き、7.1に進みます。

ヒント＆ノート：

• ステップ4.5と4.6で、大気への組織のどの部分の露出を最小限にするために完全に水没する組織を十分FACSバッファを使用してください。
• 〜30度曲がっている½インチ長さ26ゲージの針は、より肝門脈にPBSの注入を容易にすることができます。
• 適切に灌流すると、肝臓は1 - 2mLのPBSを注入した後、薄茶色に暗赤色の色からになります。
• 肝臓がFACS分析のために必要でない場合は、血流は必要ありません。肝臓を単離し、ストマッカー袋に直接回収し、手順7で説明したように処理することができます。
• それは細菌のCFUと脾臓と肝臓での免疫細胞の生存への影響は最小限に抑えているため、マウスの安楽死のために、CO ₂窒息は好ましい方法である。採血が不要な場合は、頸椎脱臼は、別の安楽死の方法として使用されることがあります。それは、臓器の重量や免疫細胞の生存率に影響を及ぼす可能性のある安楽死の方法は、（例えばthiobarbiturates）使用しないことをお勧めします。

5。 FACS分析のための肝細胞懸濁液の調製

1. 60ミリメートルペトリ皿の内側に70μmのセルストレーナーでFACSバッファー（ステップ4.5）で肝臓を配置することにより、単細胞懸濁液を生成します。単一細胞懸濁液が形成されるまで5 mLの注射器のプランジャーを使用してセルストレイナーを通して組織を押してください。
2. 50 mLコニカルスクリューキャップチューブにペトリ皿から肝単一細胞懸濁液を移すとコールドFACS緩衝液で40mLの全量をもたらす。
3. 渦の細胞懸濁液と肝臓のための細菌負荷を決定するために1mLのアリコートを取る。 7.3ステップとストマッカー袋の組織ホモジネートの代わりにこの1 mLずつを使用して行く。
4. 4℃で5分、500 × gで℃で遠心分離により細胞をペレット化するには、4℃で5分間、40mLの冷FACSバッファーでペレットを再懸濁します、ペレット500 × gで遠心分離により細胞を上清を捨て、そして上清を捨てる。
5. 室温で20 mLの等張パーコールで細胞ペレットを再懸濁します。室温で12分間、700 xgで細胞懸濁液を遠心してください。 （すなわち、肝細胞）上に浮遊細胞の上清と円盤状のシートを捨てます。まで頻繁に逆転で10分間の室温で赤血球とインキュベート細胞を溶解するために4 mLのTACのバッファに白血球含有ペレットを再懸濁します。
6. 新しい10mLの遠心チューブに100μmのナイロン膜を通ってフィルタ細胞懸濁液。
7. アンダーレイは、1 mLのFCS / EDTA緩衝液で細胞懸濁液をろ過した。 350 × gで遠心する4℃5分° Cは、上清を捨て、そして5mLのFACS / EDTA緩衝液に再懸濁します。
8. 、4℃5分° C、350 xgで細胞懸濁液を遠心上清を捨て、そしてペレットのサイズに応じて0.5から3 mLのFACS / EDTA緩衝液に再懸細胞ペレット。
9. ステップ5.8でサスペンションのボリュームに応じて、トリパンブルーでの細胞懸濁液の1:5-1:20を希釈する。血球計（図4A）を使用して実行可能な肝白血球をカウントし、次のように、総生存細胞決定：カウント面積×希釈率で細胞の生存細胞/臓器=数× 10 ^{4 ×}体積（mL）を。肝臓の単細胞懸濁液は、所望の細胞表面マーカーに特異的な抗体で標識し、FACSにより解析することができます。

ヒント＆ノート：

• 特に指定のない限り、氷上で細胞を維持する。

6。 FACS解析のための脾臓単一細胞懸濁液の調製

1. 60ミリメートルペトリ皿の内側に70μmのセルストレーナーでFACSバッファーで脾臓の半分（ステップ4.7）配置することにより、単細胞懸濁液を生成します。単一細胞懸濁液が形成されるまで穏やかに5 mLシリンジのプランジャーを使用してセルストレイナーを通して組織を押してください。
2. ペトリ皿から10 mLの遠心分離管に脾臓単一細胞懸濁液を移すとコールドFACSバッファを用いて10mLの全量をもたらす。
3. 4℃で5分間℃で350 × gで遠心分離により細胞をペレット化するには、上頻繁に逆転で10分間の室温で赤血球、インキュベート細胞を溶解するために4 mLのTACのバッファの上清、再懸濁し、細胞ペレットを捨てる。
4. 新しい10mLの遠心チューブに100μmのナイロン膜を通ってフィルタ細胞懸濁液。
5. アンダーレイは、1 mLのFCS / EDTA緩衝液で細胞懸濁液をろ過した。 5 4で分° C、上清を破棄し、そして5mLのFACS / EDTA緩衝液に再懸濁し、細胞ペレット350 × gで遠心。
6. 、4℃5分° C、350 xgで細胞懸濁液を遠心上清を捨て、そしてペレットのサイズに応じて3〜8 mLのFACS / EDTA緩衝液に再懸細胞ペレット。
7. ステップ7.6のサスペンションのボリュームに応じて、トリパンブルーで1:20（蒸留水で0.4％） - 細胞懸濁液1:10希釈する。血球計を使用して実行可能な脾細胞をカウント - 臓器の脾臓の単細胞懸濁液当たりの総生存細胞を計算するためのステップ5.9を参照し、目的の細胞表面マーカーに特異的な抗体で標識し、FACSにより解析することができます。

ヒント＆ノート：

1. 特に指定のない限り、氷上で細胞を維持する。

7。 リステリア感染マウスから採取した組織中の細菌負荷の測定

1. 脾臓の半分を含むストマッカー袋の上部を折る。漏れを防ぐためにシャットダウンストマッカー袋を押しながら、クリーンベンチ上または層流キャビネット内に平らに置きます。組織が袋内にマッシュアップされるまで、組織の上に太い丸ペンを転がし。
2. マッシュポテト組織を含む各ストマッカー袋にPBS 5 mlを加える。ストマッカーにストマッカー袋を置き、10分間高速でストマッカーを実行する。
3. ピペットでストマッカー袋（または肝細胞懸濁液1 mLずつ）でホモジネートを混ぜる。重複で以下を実行します。 96ウェル平底プレートに300μLを転送する。 96ウェルプレートのウェル内の各組織ホモジネート試料の10 ^-5希釈1:10〜希釈系列を（270μLのPBSに30μL）を実行。
4. 慎重にガラススプレッダーを使用して予備乾燥したHBAのプレートの上に各希釈液の0.1mLを広げる。 37℃で一晩培養する。
5. 各希釈のためのCFUの数をカウントし、考慮に組織の一部（例えばhalf脾臓）、希釈率、および組織ホモジネートの総容積（5 mLまたは40 mL）をとる組織あたりCFU計算：CFU /組織を= CFU/0.1 mLの×希釈率× mLの/組織、脾臓のためには、組織のホモジナイズに使用する脾臓のサンプルの重量パーセント（ステップ4.7参照）ことによって、この数値で割ります。

ヒントと注意事項：

• 複数のストマッカー袋は、製造業者によって指定された最大音量を超えていないか、総容積限り、一度にストマッカーに配置することができます
• ストマッカーが利用できない場合、組織ホモジナイザーを代わりに使用することができます。また、以下の方法、効率的ではないが、また手動でのステップ7.1と7.2の代わりにオルガンを柔らかくするために使用することができます。密封滅菌ビニール袋の代わりにオルガンやバッグを押しながらクリーンベンチ上に置くには、漏れを防ぐためにシャットダウンする。組織が完全にマッシュアップされるまで、袋以上の繰り返しを500mLの実験室のガラスのボトルをロールバックします。各袋にPBS 5 mLを加え、7.3に進みます。
• それは、HBAのプレートが完全に乾燥することをステップ7.4で非常に重要です。（寒天上に水分をすなわちしない）。それ以外の場合は正常にカウントすることができる明確なリステリア菌のコロニーを得ることが困難な場合があります。
• 限られたHBAのプレートがある場合は、別のステップ7.4です：五から六の項で、各希釈液についてつにそれを分割する予備乾燥したHBAのプレート（ステップ1.1）の下部に線を描画します。慎重に各組織ホモジネート用HBAプレート上の対応するセクションに各希釈液の25μLをピペット - スプレッダーで広げていません。組織ホモジネートの滴が反転板の前に乾燥されるまで待ちます。 37℃で一晩インキュベートする。最大80コロニーまでは、寒天プレート上に一滴のために区別することができます。
• 組織ホモジネートの希釈は動物のリステリア菌の成長に依存するかもしれませんし、安楽死の時に動物で表示される症状に基づいて推定することができる。著しく瀕死状態であるマウスの場合は、追加の希釈は、より正確に細菌負荷を決定するために必要な場合があります。感染期間の終了時に安楽死リステリアまたはマウスの低用量を接種したマウスの場合は、希釈していない組織ホモジネートは、細菌負荷を決定するために使用されることがあります。
• プレートを2〜3日、37℃で一晩または室温でインキュベートすることができます。

8。代表的な結果：

標準的な感染実験では、 リステリア菌は、冷凍グリセロールストックから得られたものであり、図1に示すようにHBAのプレートにストリーク。いくつかのコロニーがストリーキング後に得てい​​る場合、これは悪いストリーキングまたは最適な凍結ストック未満を示している可能性があります。 リステリア感染株は、新しく作製したHBAのプレートから調製し、-70℃で保存した。細菌クリアランスと免疫応答を測定するために、我々は日常的に2500 CFU / mLに融解リステリア感染株式を希薄化する- 15,000 CFU / mLおよび500でそれらを感染させる200μLをマウスに注入する- 3,000 CFU。我々は、このプロトコルを使用してリステリアのサブ致死量に感染したマウスが一時的に最初の数日以内に波立た毛皮、猫背の姿勢や体重減少を示す可能性があることを確認します。これらの症状は、それがグループの残り（すなわち、"明白な"外れ値）に異なる応答するかどうかを、個々のマウスが感染に与える影響を深刻なのビジュアルなヒントを提供し、過度の苦痛と差し迫った死を防ぐために安楽死が必要であるかどうか感染に起因する。

図2-5で表される結果では、マウスはリステリア感染株式の新鮮な融解したアリコートを用いて感染させた。異なる時点で感染後、マウスを安楽死さと肝臓と脾臓を摘出した。図2は、単一のマウスの希釈脾臓のホモジネートを培養されたHBAのプレートを示しています。希釈率が高くなるように、別個のCFUをカウントする少なくとも二つの希釈が可能であるようなコロニー数の明らかな減少があるはずです。マウスは、 リステリア感染症（すなわち、検出限界= 100 CFU /組織）をクリアしている場合は、<5 リステリアコロニーは未希釈の組織ホモジネートの200μLで拡散されたHBAのプレート上に存在することになります。肝臓および/ ​​または脾臓の単離中に腸や他の外部の細菌で汚染される場合、HBAのプレート上のコロニーは、別の形態（すなわち、特性ハローとリステリアコロニーの淡い色を持っていない）及び/または可能性を示す可能性が高い用が期待されているものにコロニー数の異なるリステリア菌 （すなわち少なすぎるまたは多すぎる）。図3は、C57BL / 6マウスの代表的なリステリア菌クリアランス曲線を示しています- リステリア菌は、通常、肝臓よりも脾臓からより迅速にクリアして、そのクリアランスは、5日間の感染後までに行われないことに注意してください。

図4は、感染後の異なる時点で感染マウスの脾臓および肝臓から調製した単細胞懸濁液に基づいて細胞数を示しています。このメソッドは、肝臓と脾臓から> 80％から調製した単細胞懸濁液で> 95％白血球純度を達成することができます。白血球純度は汎白血球マーカーCD45（クローン30 - F11）に特異的なモノクローナル抗体を用いたFACS分析によって決定することができる。一般的に、脾細胞および肝白血球の数は、脾臓の脾細胞の増加と比較して、それが肝臓の白血球の高い倍の増加を示す肝臓の感染をクリアするのにかかる期間中に増加するが、実質的に小さい合計。免疫細胞の種類と数は、細胞表面マーカーに特異的な抗体との単細胞懸濁液を標識することにより決定することができます。標識された細胞は、FACS分析によって検出することができます。図5は、CD8 ⁺ T細胞の代表的な結果を提供します。 C57BL / 6マウスにおける標準的リステリア感染の間に、CD8の数⁺ T細胞は一過性2月3日befor日目に脾臓中のリンパ球減少による減少eは脾臓と肝臓の両方で5日目、感染後から著しく増加します。

リステリア菌に縞模様図1。HBAプレート。滅菌白金耳を凍結グリセロールストックからリステリアストリークするために使用された。プレートは37℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを取り囲む特徴ハローはβ-溶血によるものです。

図2組織は、HBAのプレート上で培養したリステリア感染マウスからホモジネート。肝臓は3日、感染後におけるリステリアに感染したC57BL / 6マウスから収穫された。組織ホモジネートを調製し、希釈液は、10 ^-4希釈（）と10 ^-5希釈（B）、同様に希釈していないから10までの各10倍希釈用のHBAのプレート上に25μlの降下を広める100μlの完全な板に配置された^-5（C）。プレートは37℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーの計数を有効希釈はその時点で、感染後の細菌負荷（すなわち、CFU /組織）を決定するために使用されています。

図3感染3におけるC57BL / 6マウスと7日、感染後の脾臓および肝臓におけるリステリア負荷。 C57BL / 6マウスは、 リステリアの〜2,000 CFUを感染させた。各時点で、マウスは肝臓を灌流して脾臓で収穫された、安楽死さ、および脾臓のホモジネート（A）または肝単一の細胞懸濁液（B）の希釈液は、細菌負荷を決定するためにHBAのプレート上で培養した。実線は、幾何平均を示し、縦棒はSEMを示す。点線は、細菌負荷の正確な測定の検出限界は、この実験では100 CFU /器官であることを示します。

図4感染マウスから採取した組織のための生存細胞数。 C57BL / 6マウスは、 リステリアの〜2,000 CFUを感染させた。各時点で、マウスは、安楽死肝臓は、灌流および脾臓で収穫した。細胞はトリパンブルーで染色し、ステップ5.9（）で説明されているように血球計を用いてカウントした。脾細胞（B）と肝白血球（C）は、 リステリア感染マウスから調製した単細胞懸濁液から得られたカウント。線は幾何平均を示している。

図5。CD8のFACS分析⁺ リステリア感染マウスにおけるT細胞。 C57BL / 6マウスは、 リステリアの〜2,000 CFUを感染させた。各時点で、マウスは、安楽死肝臓は、灌流および脾臓で収穫した。単細胞懸濁液は、T細胞（CD3、TCRβ、CD4、CD8）に特異的な抗体で染色した。 （A）％CD8を持つ代表的なFACSプロファイル⁺ T細胞+ / - SEM。脾臓における（B）の合計CD8 ⁺ T細胞。肝臓での（C）の合計CD8 ⁺ T細胞。

ディスカッション

Listeriaは、細胞内細菌に対する宿主の免疫応答を特性解析するために最も広く利用されている生物の一つである⁶。本プロトコルでは、特定のマウスの同一組織内において、細菌量と免疫細胞応答の両方を測定することが可能となる。感染マウスごとに特定の組織からこれら2つの指標を測定することで、マウスコホート内（異なるマウス系統または感染後の異なる時点）およびコホート間でのより堅牢な比較が可能になる。経口投与によるListeria感染を用いてマウスの免疫応答を研究することも可能だが、静脈内注射による感染が頻繁に用いられる理由は以下の通りである：1) 血流への迅速かつ効果的な導入が保証されるため、2) 同期した一貫性のある全身感染が誘導されるため、そして3) Mus属はE-カドヘリン受容体をコードする遺伝子に突然変異を有しており、これが経口投与によるListeria感染を制限しているため（この変異は、ListeriaがマウスのE-カドヘリン受容体に結合し、胃腸管の上皮層を効率的に通過する能力に影響を与える）^16-18。

このプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、生存率と毒性を確保するため、Listeria接種株は新鮮なHBA overnight培養液から調製する必要があります。次に、最初に接種したマウスと最後に接種したマウスの間でCFU濃度に大きな差が生じないように、すべてのマウスへの接種前後に接種株のCFU濃度を正確に測定することが重要です。第三に、マウスへのListeriaの尾静脈注射は、すべての個体で一貫して行う必要があります。最後に、末梢血中を通過する白血球ではなく、肝臓内の免疫細胞を正確に測定するために、肝臓を灌流して非定在性白血球を除去させる必要があります。これらのステップのいずれかが適切に行われない場合、Listeriaに感染させた個々のマウス間で、細菌量や免疫反応に不要なばらつきが生じる可能性があります。

本プロトコルの2つの制限事項は、静脈注射によるマウス感染させる研究者のスキルと、組織内における細菌量の検出です。1人の担当者が多数のマウスに注射を行う場合、凍結保存した接種液を融解してから時間が経過すると（例：最初のマウスと最後のマウスへの注射の間隔が>2時間）、Listeriaの生存率（すなわちCFU濃度）が低下する可能性があります。接種液の品質が損なわれる前に何匹のマウスに注射できるかは、研究者が判断する必要があります。本手法のもう一つの制限は、培養した組織ホモジネートの量が比較的少ないため、1器官あたり100CFU未満のListeria量は正確に測定できないことです（例：図3は、検出限界が100CFU/organであることを示しています）。1器官あたりのCFUのより低い値をより正確に測定するには、より多くの量の組織ホモジネートを培養することで（1プレートあたり最大0.5mL、複数プレートの使用が可能）、Listeria検出のためにサンプリングされる組織の割合を増やすことができます。ストマッカー（Stomacher）が利用できない場合は、ステップ7.1-7.2において、組織ホモジナイザーなどの代替的な組織ホモジナイズ方法を使用できます。実用的な注意点として、感染マウスからの組織サンプルの培養に用いる37°Cインキュベーターのスペースが限られている場合は、HBA培養プレートを室温で2〜3日間インキュベートすることも可能です（室温ではコロニーの増殖速度は遅くなります）。ただし、凍結保存用Listeriaストックを調製するための培養を行う際は、室温を使用しないでください。

このプロトコールは、マウスにおけるListeria感染を特性評価するための基本的なアプローチを提供するものであり、EGD以外の他のListeria株にも適用可能です。肝臓および脾臓に加えて、リンパ節から単一細胞懸濁液を作製することもできます。いずれの場合においても、これらの単一細胞懸濁液は、免疫細胞サブセットの測定や、ソートした免疫細胞のin vitro刺激など、さまざまな解析に使用できます。基本的な手法を習得すれば、このプロトコールを修正して、Listeria特異的T細胞の単離¹⁹、樹状細胞の特性評価²⁰、あるいは感染後の特定の時点における免疫細胞の除去^21,22を行い、Listeria感染マウスにおける免疫応答をより詳細に特性評価することが可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
馬血液寒天ベース2号	オキソイド	CM0271	HBAプレート用寒天ベースの準備
馬の血（繊維素）	オキソイド	HB1000	寒天ベースに5〜10％を加算
ブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス（10mL）を	オキソイド	TM456
脳心臓浸出液乾燥メディア	オキソイド	CM1135
96ウェル平底プレート	BDバイオサイエンス	353072
70μmのセルストレーナー	BDバイオサイエンス	352350
小さなペトリ皿	BDバイオサイエンス	351007
ストマッカー80バイオマスターラボシステム	スワード
プラスチックストマッカー袋	ザルスタット	86 9924 530
ウシ血清アルブミン	シグマ	A3912
FACSバッファー			0.1％（w / v）のPBSに牛血清アルブミン
等張パーコール（33.75パーセントPBSでパーコール）	GEヘルスケア	17-0891-01	33.75mLパーコール、3.75mL 10倍PBS、62.5mL 1X PBSは、100mLの等張パーコールしています
TACバッファ			17mmのトリス、蒸​​留水で140mmの塩化アンモニウム
FCS / EDTA緩衝液			10mMのEDTAとウシ胎児血清
FACS / EDTA緩衝液			FACSバッファ+ 5mMのEDTA
トリパンブルー	シグマ	T6146	PBSの0.4％（w / v）の、滅菌フィルタ
2mLのクライオバイアル	グライナーバイオワン	121263
27 gauge/1mLインスリン注射器	テルモメディカルプロダクツ	SS10M2713
針	テルモメディカルプロダクツ	NN - 2516R（25G 5/8in） NN - 2613R（26G 2インチ）
注射器	テルモメディカルプロダクツ	SS - 01T（1mLの）、SS - 053（5ml）を、SS - 10S（10ml）を