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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. SPIO-MtbsAb合成
- 以前に報告された方法を使用して、SPIO共役2,2'-(エチレンジオキシ)ビスエチルアミン(EDBE)を合成します。
- SPIO-EDBE-無水コハク酸(SA)を合成します。
- SPIO-EDBEとSA(1 g;10 μmol)のアルカリ性溶液(5 M NaOH;10 mL)を室温で24時間撹拌します。
- 分子多孔質メンブレンチューブ(12,000-14,000 MWカットオフ)を使用して、2 Lの蒸留水を20回交換して溶液を透析します。各変更ごとに6時間。
- 最後に、100 μL の SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL の Fe) を 400 μL の 4.5 mg/mL 結核菌表面抗体 (MtbsAb) に加え、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールと (ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ) トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロリン酸を触媒として使用して SPIO-MtbsAb を合成し、溶液を室温で 24 時間撹拌します。
- 最後に、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、非結合抗体から溶液を分離します。
- 反応混合物(5 mL)を2.5 cm×33 cmのカラムにロードし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーを使用して溶出します。Ab-ナノ粒子複合体(ナノプローブ)をビシンコニン酸タンパク質アッセイキットを用いて確認します。
2. 粒子形態観察と緩和層測定
- 平均粒子径、形態、およびサイズ分布を透過型電子顕微鏡を用いて100kVの電圧で調べます。
- 複合分散液を200メッシュの銅グリッドにドロップキャストし、室温で風乾させてから顕微鏡にロードします。
- ナノプローブの緩和時間値(T1およびT2)を、NMRリラクソメータを使用して、20 MHzおよび37.0 °C±0.1 °Cで測定します。
- 各測定の前に、リラクソメーターを校正してください。
- 反転回復によって生成された 8 つのデータ ポイントと Carr-Purcell-Meiboom-Gill パルス シーケンスから r1 と r2 の値をそれぞれ記録して、r1 と r2 の緩和性を決定します。
>3. 細胞イメージング
- RPMI 1640 でヒト単球 THP-1 を RPMI 1640 で培養し、10% ウシ胎児血清、50 μg/mL 硫酸ゲンタマイシン、100 単位/mL ペニシリン G ナトリウム、100 μg 硫酸ストレプトマイシン、0.25 μg/mL の真菌ゾンを 37 °C の 5% CO2 インキュベーターで培養します。
- SPIO-MtbsAbナノプローブ(2 mM)を、1 × 107活性化単球と1 7活性化単球を1 mLの微量遠心チューブで37°C、37°C、1時間インキュベートしたMycobacterium bovis BCGのコロニー形成ユニット(CFU)とインキュ
ベートします。
- チューブを200 x gで遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを培地(200μL)に再溶解します。
- 高速グラジエントエコーパルスシーケンス(繰り返し時間(TR)= 500;エコー時間(TE)= 20;フリップ角度= 10°)を3.0-T MRIで測定し、ナノプローブの特異性と感度を決定します。
4. BCG(カルメット・ゲラン菌)接種
- 凍結乾燥ワクチンまたは細菌ストックをSautonの培地で再構成し、前述のように適切に分散するまでストックを生理食塩水で希釈します。.
- ADIMMUNE(台北、台湾)から入手したM. bovis BCGの弱毒生株を接種します(Connaught株;ImmuCyst Aventis、Pasteur Mérieux)を0.1 mL /マウス(すなわち、107 CFU)の容量で、前述のようにマウスの左または右の肩甲骨背皮膚に皮内投与します。ネガティブコントロールとしてマウスに生理食塩水を注入します。BCG接種後、毎日動物を監視します。
- バクテリア接種1ヶ月後に動物を生贄に捧げ、二酸化炭素安楽死を行います。皮内接種部位から組織を採取します。組織を10%ホルマリンで固定し、5〜10μmの連続切片のパラフィンに埋め込みます。抗酸性細菌の場合はヘマトキシリン/エオシンおよびZiehl-Neelsen染色で、第二鉄の場合はベルリンブルーで組織切片を染色します。
5. 生体内MRI
- ケタミン(80 mg / kg体重)とキシラジン(12 mg / kg体重)をマウスに皮下注射して動物麻酔を行います。.
- SPIO-TbsAbプローブ(2 nmol/200 μL)をマウスの尾静脈に注入します。プローブ注入前と注入直後のMR画像マウス、その後5分ごとに30分間、T2強調高速スピンエコー画像(TR = 3000;TE = 90;視野 = 8)。
- 信号強度(SI)を使用して、信号強度(SI)を使用して、Mtb肉芽腫の中心と肉芽腫領域に隣接する背筋の同等の位置で定義された関心領域の測定値を使用して、すべてのMR画像を定量的に分析します。
- 造影剤の注入前(SIpre;control)および注入後0〜3時間(SIpost)のSI測定を使用して、式
を使用して相対的な信号増強を計算します
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
ここで、SIpre は強化前スキャンの病変の SI であり、SIpost は強化後スキャンの病変の SI です。