哺乳類細胞からの組換え抗体の作製と精製

要約

出典: Shivange, Gururaj, et al. 標的抗原特異的治療抗体の腫瘍および組織分布の分析。 (2020年)。

動画では、遺伝子発現から分泌まで、哺乳類の宿主細胞で抗体が産生される過程を説明しています。これには、転写、翻訳、シグナル認識、正しいフォールディング、そして最終的には分泌小胞を介した細胞外培地への放出が含まれます。

プロトコル

1. 抗体の発現と精製

1. CHO細胞のメンテナンス
   1. 市販の1xグルタミンサプリメントを添加したFreeStyle CHO培地で、ガラス製または使い捨てのデロング三角フラスコを使用して、130 rpm、5% CO₂で37°Cで振とうします。
      手記：攪拌を増やし、振とう条件でのガス移動を改善するために、通気口付きキャップ付きのバッフルフラスコを使用することを強くお勧めします。懸濁液培養の攪拌が限られているため、通常のフラスコ(非バッフル)では、抗体収量が大幅に減少しています。
   2. 細胞数を1〜5 x 10⁶細胞/mLに維持し、細胞生存率は>95%です。細胞数が5 x 10⁶細胞/mLを超えて増加した場合は、細胞を分割します。CHO細胞が0.2 x 10⁶細胞/mL未満に達するのを絶対に許可しないでください。
2. CHO細胞のトランスフェクション
   1. 200 mLの培地(2 x 10⁶細胞/mL)でCHO細胞を増殖させ、デロング三角バッフルフラスコで増殖させます
      手記：バッフルフラスコで増殖した懸濁培養物は、非バッフルフラスコで増殖した場合と比較して、常に高いタンパク質収量を生み出しています。
   2. 15 mLのチューブに5 mLのCHO FreeStyle培地を取り、50 μgのVHクローンDNAと75 μgのVLクローンDNAを加えます。よく混ぜる渦
   。
   3. DNA混合物を室温で5分間インキュベートします.
      手記：インキュベーションが長くなると、タンパク質の収量が減少します。
   4. 1 mg/mL ポリエチレンイミン (PEI) ストック 750 μL を DNA 溶液に加え、混合物を 30 秒間積極的にボルテックスします。室温でさらに 5 分間インキュベートします
      手記：PEIは新鮮にする必要があります。PEIの複数回の凍結融解サイクルは、全体的な収量を大幅に減少させます。
   5. DNAとPEIの混合物全体を細胞に加え、フラスコを手動で振とうします。すぐに、デロング三角バッフルフラスコを37°Cの細胞で130rpmで振とうします。
3. 式
   注:抗体には、N末端まで設計された分泌シグナルペプチドがあり、抗体が培地に分泌されるのを助けます。
   1. トランスフェクションした細胞を37°Cで増殖させ、1日目に130 rpmで振とうします。
   2. 2日目に、2 mLの100倍凝集防止剤と2 mLの100倍抗菌抗真菌溶液を加えます。フラスコを130rpmで振とうしながら、より低い温度(32〜34°C)に移します。
   3. 5日おきに、10 mLのトリプトンN1飼料と2 mLの100倍グルタミンサプリメントを追加します。.
   4. トリパンブルー染色で細胞のアリコートを染色した後、血球計算盤を使用して3日ごとに細胞を数え続けます。細胞生存率が80%を超えていることを確認してください。
   5. 10日目または11日目に、抗体精製のために培地を回収します。培養物を3000 x g、4°Cで40〜60分間遠心し、0.22 μMボトルフィルターを使用して透明培地をろ過します。
4. 精製
   手記：抗体の精製は、市販のProtein-Aカラム(材料表を参照)を使用し、ペリスタルティックポンプを使用して行います。
   1. 2カラム容量の結合バッファー(pH 7.4で20 mMリン酸ナトリウム)でカラムを平衡化します。
   2. 抗体を含むろ過培地(ステップ1.3.5で取得)を1 mL/minの流速でカラムに通します。
   3. カラムを2カラム容量の結合バッファーで洗浄します。
   4. 5 mLの溶出バッファー(pH 3.4の30 mM酢酸ナトリウム)を使用して、抗体を500 μLの画分に溶出します。
   5. 溶出した抗体のpHを中和するには、10 μLの中和バッファー(pH 9で3 M酢酸ナトリウム)を1フラクションあたり10 μL加えます。
      手記：分数3〜6には、ほとんどの抗体が含まれています。抗体が予想よりも遅い画分で溶出される場合に備えて、すべての画分を保持することをお勧めします。
   6. IgGのデフォルトプロトコルを選択することにより、分光光度計を使用して精製された抗体の濃度を測定します。抗体の最終濃度は、分子量と吸収係数を考慮してmg/mLで求められます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FreeStyle CHO メディア	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 12651-014
アンチアンチ(100X)	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 15240-062
凝集防止剤	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 01-0057DG
BDインスリンシリンジ	BDバイオサイエンス	カタログ番号 #329420
キャリパーIVISスペクトラム	パーキンエルマー	ネコ #124262
CHO CDエフィシェントフィードB	ギブコライフテクノロジーズ	ネコ #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (ダルベッコ改変イーグルスミディアム)	コーニング	カタログ番号 # 10-13-CV
コーニング 500 mL RPMI 1640	コーニング	カタログ番号 # 10-040-CV
Cy5標識抗ヒトIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究	カタログ番号 # 709-175-149
GlutaMax-I (100倍)	ギブコライフテクノロジーズ	カタログ番号 # 35050-061
HiPureプラスミドMaxiprepキット	インビトゲン	カタログ番号 # K21007
HiTrap MabSelect SuReカラム	GEヘルスケア	カタログ番号 # 11-0034-93
イソフルラン、USP	コトラス	カタログ番号 # 11695-6777-2
潤滑剤眼軟膏	リフレッシュラクリルーブ	ネコ #4089
PEIトランスフェクション試薬	サーモフィッシャー	ネコ # BMS1003A
実験モデル:細胞株
人間:OVCAR-3	アメリカンタイプカルチャーコレクション	ATCC HTB-161
ヒト:CHO-K細胞	私たちの研究室で安定した形質転換	ATCC CCL-61
マウス:4T1	UVAのチップ・ランデン博士からの親切な贈り物
マウス:MC38	UMBCのスザンヌ・オストランド・ローゼンバーグ博士からの親切な贈り物	STR プロファイリングによる認証