HA抗体によるFc媒介エフェクター機能の活性化の測定

要約

出典:Bailey, M. J., et al. A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、T細胞エフェクター機能の抗体を介した活性化を測定するアッセイを実演しています。HAを発現するトランスフェクションされた哺乳動物細胞にインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)特異的モノクローナル抗体を添加すると、HAとの免疫複合体が形成されます。Fc受容体を発現する遺伝子操作T細胞とルシフェラーゼレポーターを導入すると、T細胞は抗体-HA複合体によって活性化され、この活性化はルシフェラーゼ基質を添加して産生された生物発光を測定することによって検出されます。

プロトコル

1. トランスフェクションによるインフルエンザウイルスヘマグルチニンの発現

1. 白組織培養処理した96ウェルプレートで、密度2 x 10⁴細胞/ウェルのヒト胚性腎臓(HEK 293T)細胞をプレート化し、37°Cインキュベーター(5%_CO2)で4時間
放置します。
2. ウイルスヘマグルチニンをコードするDNA100 ngとウェルあたり0.2 μLのトランスフェクション試薬を含む細胞を、総容量50 μL.
   手記：プラスミド試薬とトランスフェクタント試薬の両方を、1x Opti-Minimum Essential Media(MEM) Reduced Serum Mediumで希釈します。
3. 37°Cインキュベーターでプレートを5% CO₂と共に18時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を取り出します。

2. モノクローナル抗体または血清によるFcRg/NFATを介したルシフェラーゼ活性の活性化の評価

1. まず、トランスフェクションした細胞の増殖培地を25 μLのアッセイ培地(1x RPMI 1640に4%(vol/vol)低IgGウシ胎児血清を添加)で置き換えます。
2. 別の96ウェルプレートで、アッセイ培地を使用して、目的の抗体を30 μg/mLから4倍希釈します。3回に分けて希釈を行い、プレートレイアウトの例を図1Aに示します。抗体を除外するコントロール(抗体コントロールなし)とバックグラウンドコントロール(アッセイバッファーのみ)が含まれていることを確認してください.
   手記：「抗体なし」コントロールとバックグラウンドコントロールの両方で、抗体の代わりに25 μLのアッセイバッファーを添加します。
3. ステップ2.2で段階希釈した抗体25 μLを、トランスフェクションした細胞のプレート上の対応するウェルに移します。
4. プレートを37°Cのインキュベーター(5% CO₂を含む)で15分間インキュベートします。
5. マウスFcgRIVまたはヒトFcgRIIIaを発現する適切な修飾エフェクターJurkat細胞(75,000細胞/ウェル)を25μL加えます。各ウェルの総容量は 75 μL で、抗体の開始最終濃度は 10 μg/mL です (図 1B).
   手記：バックグラウンドコントロールには、エフェクター細胞の代わりに25 μLのアッセイバッファーを添加します。抗体依存性細胞性食作用を調べるために、ヒトFcgRIIaを発現する修飾Jurkat細胞を使用することができます。
6. プレートを37°Cのインキュベーターで5%_CO2とともに6時間インキュベートします。
7. ルシフェラーゼ基質バッファーを37°Cの水で約1時間解凍し、温めてから使用してください.
   手記： ルシフェラーゼ基質バッファーを作製するためには、凍結乾燥ルシフェラーゼアッセイ基質を付属のアッセイバッファーに再構成します。再構成した基質バッファーは、-30°Cから-10°Cで最大6週間保存できます。
8. 75 μL/ウェルのルシフェラーゼ基質バッファーを、バックグラウンドコントロールを除くすべてのウェルに加えます。
9. 照度計で読み取ります。
10. フォールドインダクション = (誘導値 - バックグラウンド値) / (mAb 値なし - バックグラウンド値) の式でフォールド誘導を計算します。

結果

図1:サンプルプレートのレイアウトと実験グループの構成の概略図。 (A)各抗体サンプルの開始濃度は10 μg/mLで、プレート(カラム1からカラム12)全体で4倍に段階希釈します。各サンプルはトリプリケートで行われます。行 G は mAb なしコントロール用に予約されており、行 H はバックグラウンドです。(B)ルシフェラーゼ基質バッファーを添加する前の各実験群の最終容量は75μLです。注目すべきは、サンプルと「mAb なし群」には 25 μL のエフェクター細胞が添加されているのに対し、バックグラウンドコントロール群には 75 μL のアッセイ培地が含まれていることです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HEK 293T細胞	ATCCの	CRL-3216	ヒト胚性腎臓細胞
リポフェクタミン 2000	ライフテクノロジー	11668019	トランスフェクション試薬
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium (1X Opti-MEM 還元型血清培地)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51985-034
白組織培養処理済み96ウェルプレート	コーニング株式会社	3917	アッセイプレート
10倍MEM	ギブコ	11430-030
マウスFcgRIVを発現するJurkat細胞	プロメガ	M1201	キットには、細胞、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMI、低IgG血清が含まれます
ヒトFcgRIIIaを発現するJurkat細胞	プロメガ	G7010	キットには、細胞、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMI、低IgG血清が含まれます
ヒトFcgRIIaを発現するJurkat細胞	プロメガ	G9901	キットには、細胞、Bio-Gloルシフェラーゼアッセイシステム、1X RPMI、低IgG血清が含まれます
ルミノメーター	ビオテック	Synergy H1 マルチモードリーダー	発光板リーダー
Bio-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム	プロメガ	G7940	ルシフェラーゼアッセイバッファーとルシフェラーゼアッセイ基質を配合