中和抗体に対するインフルエンザウイルスエスケープバリアントの作製

>注:ウイルスの複製を阻害するHA特異的抗体は、一般に、i)球状頭部上部の受容体結合部位または受容体結合部位に隣接するものと、ii)球状頭部の外側とHAの茎領域を含む受容体結合ドメインの遠位部に結合するものに分類できます。受容体結合部位を標的とする抗体は、標的細胞表面のシアル酸モチーフの関与を防ぎ、赤血球凝集阻害(HI)アッセイを用いて測定することができます。茎特異的抗体など、HI陰性の抗体でもウイルスの複製を阻害することはできますが、中和アッセイを用いてのみ評価することができます。

1. HI活性に基づく抗体の分類

1. HIアッセイ
   1. 96ウェルV底プレートで、カラム2〜12に25 μLの1x PBSを加えます。
   2. モノクローナル抗体(mAb)7B2(頭部特異的)、6F12(茎特異的)、およびアイソタイプコントロールを1x PBSで100 μg/mLに希釈し、希釈した抗体調製物50 μLをカラム1に分注します。また、50 μL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を添加して、mAb を使用しないコントロールを含めます (図 1A)。
   3. カラム1からカラム2に25μLを移すなどして、抗体の2倍段階希釈を行います。カラム 12 から最後の 25 μL を廃棄します (図 1A).
      手記：抗体コントロールなしの行を必ず含めてください。
   4. ウイルスストック(A/California/04/09のヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)をA/Puerto Rico/8/34の内部セグメントと発現するリアソータントウイルス)を8ヘム凝集ユニット/25μLに希釈します。希釈したウイルスストック25μL(8回赤血球凝集)を各ウェル(A列からG列)に加えます。
      手記：抗体とウイルスの混合物は、最終容量が50 μLで、開始最終濃度が50 μg/mLである必要があります。
   5. プレートを室温(RT)で45分間インキュベートします。
   6. バック滴定ロー(H)には、ウェルH2からH12に50μLの1x PBSを添加します。8つの赤血球凝集ユニットのうち100 μL/25 μLをウェルH1に加えます。H1からH2に50μLを移すなどして、2倍に段階希釈します。最後の50μLをH12ウェルから廃棄します。最後に、0.5%ニワトリ赤血球(RBC)50μLを96ウェルV底プレートのすべてのウェルに加えます><。 手記：アッセイ中のmAbサンプルの最終容量は100 μLである必要があります:mAb(25 μL)、ウイルス(25 μL)、RBC(50 μL)。モノクローナル抗体を使用しないコントロールの最終容量には、25 μL の 1x PBS、25 μL のウイルス、および 50 μL の RBC が含まれている必要があります。
   7. プレートを4°Cで1時間インキュベートします。
   8. HIアクティビティのためにプレートを視覚的に読み取ります。特定の抗体について陽性の読み出しがある場合は、ステップ2.1に進み、エスケープバリアントを生成します。抗体がHI陰性の場合は、以下のステップ1.2に進み、抗体が細胞培養アッセイで中和活性を有するかどうかを評価します
      手記： HI-active mAb のポジティブな読み出しは、ウェルの中央にある暗赤色の RBC ペレット (図 1B、7B2) で示され、96 ウェルの V 底プレートを 45° の角度で保持するとティアドロップが形成されます。ネガティブな読み出しでは、ウェル内に暗赤色のRBCペレットは形成されません(図1B;6F12、mAbなし)。また、アイソタイプコントロールは暗赤色のRBCペレットを形成しず、茎特異的抗体である6F12またはmAbなしのコントロールサンプル(図1B)と同じように見えるはずです。

2. エスケープミュータントバリアントの生成

>注:HI活性を有するまたは欠く中和抗体は、以下に説明する特定のプロトコルでさらに分析されます。

1. プロトコル1:HI陽性/中和陽性抗体(図2A)
   1. 400 μLの容量で1x PBS中に10⁶プラーク形成単位/ミリリットル(PFU/mL)のウイルスストックを調製します。
   2. 目的の抗体を、1x PBS中の濃度を上げて4回希釈します(例:0、0.5、0.05、0.005 mg/mL)、希釈あたり100 μLの容量で
      注:野生型ウイルスは、常に抗体なしで並行して継代する必要があります。これらの継代ウイルスの配列は、細胞培養条件への適応とエスケープ変異を区別するのに役立ちます。
   3. 100 μL の¹⁰ 6 PFU/mL のウイルスを、各抗体希釈液 100 μL または 1x PBS 100 μL と混合します。
   4. 37°Cのインキュベーター(5%CO₂)で1時間インキュベートします。渦を少し巻きます。各混合物200μLを特異的病原体を含まない(SPF)胚鶏卵に注入します。
   5. 卵を37°C(CO₂なし)で40〜44時間インキュベー
   トします。
   6. ウイルスに感染した胚卵を、4°Cで最低6時間インキュベートして犠牲にします。
   7. 前述のように、卵から尿膜液を採取します。
   8. 上記のように赤血球凝集アッセイを実施します。すべての尿路液製剤に赤血球凝集力価がない場合は、0.005 mg/mL から 0.00005 mg/mL の範囲の抗体希釈でステップ 2 から繰り返します。
      手記： HI陽性抗体の飽和濃度は、存在するすべてのウイルス粒子を中和する可能性があります。したがって、継代中に存在する抗体の量を減らす必要があるかもしれません。
   9. HIアッセイ(ステップ1.1)を実施してエスケープバリアントを確認します.
      手記：HI活性抗体は、標的細胞上のシアル酸モチーフのHA結合を阻害します。したがって、同族抗体の存在下では、ウイルスはRBCを凝集する能力を失います(RBCペレットの存在)。理論的には、HI活性抗体のエスケープバリアントは、同族抗体の存在下でもシアル酸モチーフに結合できるため、RBCを凝集させることができます(RBCペレットはありません)。目的の抗体のHIがまだ検出可能な場合は、抗体の開始濃度が高いステップ2.1.2のプロトコルを繰り返します。

図1:HIアッセイ。(A)96ウェルV底プレートを用いて2つのマウスH1特異的mAb7B2(頭部特異的)および6F12(茎特異的)の活性を試験するためのHIアッセイのセットアップの概略図、および(B)HIアッセイの結果の一例

図2:エスケープ変異体の生成。提案される方法論は、HIと抗体が示すマイクロ中和活性に依存します。(A)中和HI陽性抗体に対するエスケープ変異体の生成は、卵での単一の継代を必要とする場合があり、一方、(B)中和HI陰性抗体は、細胞組織培養中の抗体量が増加する複数の継代を伴う場合がある。