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方法論記事

哺乳類細胞培養物からの組換えモノクローナル抗体の作製

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典:Nogales-Gadea, G. et al., 不死化選別B細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の生成。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を持つプラスミドベクターを導入することにより、哺乳類細胞から抗体を生成する方法を示しています。これらのベクターはポリエチレンイミンと相互作用し、ポリプレックスを形成することによって細胞に入ります。その後、それらは個々のタンパク質に翻訳され、完全な抗体に組み立てられ、細胞外培地に分泌されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 末梢血単核細胞(PBMC)の単離

  1. 採血後できるだけ早く、参加者のヘパリン化血液 25 ml を 900 x g で 15 分間遠心分離します。血液が少ない場合は、それに応じて試薬を縮小します。フードで次のステップをすべて実行します。
  2. 血清をきれいなチューブに移します。後のステップでPBMCを凍結したり、自己免疫患者の場合に自己抗体を検査したりするために使用できます。
  3. 10 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地で血液を希釈し、ピペッティングで上下させて細胞を再懸濁します。
  4. ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウム(1.077 g / ml)を含む溶液15 mlを新しい50 mlチューブに加えます。.
  5. ステップ1.4で、2つの液体が非常にゆっくりと接触するまでチューブの2つの開口部を近づけて、溶液の上に血液を穏やかに層状にし、次にPBMC懸濁液を50mlチューブの上にゆっくりとデカントします。この手順は、PBMC を適切に分離するために重要です。
  6. ステップ1.5で得られたチューブを、ブレーキなしで400 x gで室温(RT)で20分間遠心分離します。
  7. 遠心分離後、PBMCを含むチューブの中央部分に現れる白いリングをピペットで回収します。
  8. 細胞を25 mLのRPMI 1640培地で洗浄します。
  9. 300 x gを室温で10分間遠心分離します。
  10. 上清を捨て、10 mLのRPMI 1640で細胞を洗浄します。ステップ1.9のように再度遠心分離します。
  11. 以前に報告されたように、ノイバウアーチャンバーを備えたPBMCを数えます。
  12. セクション2のようにPBMCを処理するか、後で使用するために次のように保管します:1000万PBMCを凍結するための凍結用1000万PBMCを1mlの10%ジメチルスルホキシド(DMSO)とステップ1.2で得られた90%血清で希釈します。徐々に凍結し、液体窒素で長期間保存します。

2. 細胞サイトメトリーによるCD22+および免疫グロブリンG(IgG+)の選別のためのPBMCの染色

  1. 25 cm2細胞培養フラスコに6 mLの完全RPMI 1640培地(L-グルタミン、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液、50 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン、および10%のウシ胎児血清)を充填し、インキュベーター内で5%二酸化炭素(CO2)の37°CでO/Nを回収します。
  2. 滅菌蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブを滅菌4%アルブミンリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で一晩(O / N)ブロックします。チューブをPBSで2回洗浄し、500 μlの完全RPMI 1640培地で満たします。ソーティング後の細胞の回収に使用します。
  3. PBMCをチューブに集め、室温で400 x gで5分間遠心分離します。
  4. セルをラベリングバッファに再懸濁し(手順2.5および2.6を参照)、カウントします。標識バッファーは、無菌の2%ウシ胎児血清とPBS中の1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)です。
  5. 各細胞5個入りのFACSチューブを3本調製し、100μlの標識バッファーに再懸濁します。これらのチューブは、ソーティングのゲートを定義するのに役立ちます。
    1. 1本目のチューブに5 μlの抗CD22 PerCP抗体 (メーカーのデータシートで推奨) を、2本目のチューブに20 μlの抗IgG PE (メーカーのデータシートで推奨) を添加し、3本目のチューブには何も加えません。氷上および暗闇で30分間インキュベートします。
  6. 500万個の細胞をFACSチューブ内の200 μlの標識バッファーに再懸濁し、10 μlの抗CD22 PerCPと40 μlの抗IgG PEを加えます。細胞を氷の上でインキュベートし、30分間暗所で培養します。より多くの細胞を選別したい場合は、すべての試薬をスケールアップしてください。
  7. 細胞を400 x gでローブレーキでRTで5分間遠心
    8. 分離します。
  8. 上澄みをやわらかくデカントします。
  9. 細胞を500 μlの標識バッファーに再懸濁します。ローブレーキで400 x gで細胞を5分間遠心分離し、RTでステップ2.7と2.8を繰り返します。
  10. 上清を柔らかくデカントし、細胞を300 μlのRPMI完全培地に再懸濁します。
  11. 細胞を0.45μmのフィルターに通します。セルを並べ替える準備が整いました。

3. B細胞CD22+とIgG+の選別

  1. 3本のコントロールチューブを使用して、細胞の生存率を確認します。染色のないコントロールでは、前方散布図とサイズ散布図を使用してリンパ球のゲーティングを定義します。CD22 PerCPおよび抗IgG PEを用いたコントロールは、ゲートとソーティングゲートを確立する役割を果たします。以前に報告されたデータに従って実行します。
    注:ゲートは、サイトメトリーイベントの特定のグループ(この場合は細胞)を大きなセットから分離するのに役立つ値の制限(境界)のセットです。ソーティングゲートの場合、値の制限により、定義された境界(CD22+およびIgG+)の内側にあるサイトメトリーイベント、細胞の回復が可能になります。
  2. 選別に用いるコレクションチューブとして、ステップ2.2で得られた500 μlの完全RPMI 1640培地を入れたブロックチューブを使用します。
  3. ダブルポジティブ:CD22+ IgG +のソートに進みます。各条件の最終的なセル数に注意してください。できるだけ早くフィーダーセルの上に選別されたセルをプレート化します。

4. フィーダーセルの照射

>注:選別する1〜3日前にフィーダーセルの準備を行ってください。96個の丸型ウェルプレートのウェルあたり少なくとも5,000個のwi38細胞が必要です。フードで手順4.1、4.2、および4.4を実行します。

  1. wi38細胞を37°Cおよび5%CO2で、完全なRPMI 1640培地(PBMCと同じ)で、目的の細胞数に達するまで培養します。
  2. 前述のプロトコルに従って、50グレイでそれらを照射します。wi38細胞をトリプシンして完全なRPMI培地に再懸濁した後、またはwi38を培養フラスコに付着させて照射後にトリプシン化した後、照射を行います。wi38細胞の供給者によって示されたトリプシン化の方法に従ってください。IgG+ B細胞のプレーティングに必要なウェルを覆うために必要な数の細胞を照射します(ステップ1.11でカウントした全PBMCの1%)。
  3. 96ラウンドウェルプレートの各ウェルに5,000個のwi38細胞を照射した90μlのプレート。プレートの外側の列にあるウェルは空のままにし(蒸発が速いため)、プレートの中央にある60個のウェルのみをセルのめっきに使用します。プレートをフレーミングしている外側のウェルに200μlのPBSを充填します。
  4. 必要になるまで、5% CO2のインキュベーターに37°Cで置
    5. いてください。

>5. めっき選別PBMC、エプスタイン・バーウイルス(EBV)感染と増殖

  1. 選別したPBMCを希釈し、96ラウンドウェルプレート(wi38を照射した細胞であらかじめプレーティング済み)のウェルあたり50μlのRPMI 1640完全培地に50細胞をプレート化します。EBV作業用のフードでステップを実行します。
    注:ウェルあたり50細胞の感染は最適化され、モノクローナル抗体を産生する可能性を高めますが、前述のようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってこれを検証することをお勧めします。
  2. 96ラウンドウェルプレートの各ウェルに60 μlのEBV上清 (3 - 4 x 108ウイルスコピー/mlを含む) を加えます。EBV作業中は注意が必要です。
  3. ウェルあたり1μg/mlのCpG(ODN2006)を添加します。
  4. 細胞を37°Cのインキュベーターに5%CO2で放置します。
  5. 1週間後に顕微鏡下で成長するクローンを視覚的にモニターします.
    注:B細胞増殖のいくつかの例は、以下の結果セクションで見ることができます。クローンの増殖速度は異なる場合があり、ウェルの中央で細胞塊が成長し始めるには追加の時間が必要になる場合があることに注意してください。
  6. 1st 2 weeks後、光学顕微鏡下で増殖するクローンをモニターし、最初の培地交換に進みます。ウェルの上部から90 μlの培地をゆっくりとピペッティングし、清潔な96ウェルプレートに集めます。(B細胞は井戸の底にあるため、吸引するリスクはありません)。
    1. 各ウェルに、1 μg/ml の CpG (ODN2006) と 50 U/ml の IL2 を添加した 100 μl の完全 RPMI 1640 培地を添加します。クローンが増殖している場合は、ステップ6と同様に、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、この最初の培地交換を分析します。
  7. クローンの増殖をモニターし、90μlの培地を採取し、100μlの完全RPMI 1640培地に1μg/mlのCpG(ODN2006)と50U/mlのIL2を添加して、再度増殖の3週目と4週目に培地を交換します。収集した上清を使用して、ステップ6.
    のようにELISAによるIgG産生を監視します。 注:1か月後、クローンの成長は、通常は丸い底のウェルの中央にある丸い細胞の凝集体を観察することで明らかになります。
  8. この手順では、前の週と同じ方法でメディアを変更しますが、完全な RPMI 1640 メディアのみを使用します。メディアを交換する適切なタイミングを知るための良い指標は、メディアの色であり、黄色がかったセルになっている場合は、メディア交換が必要です。
  9. 96ウェルプレートに大きなクローン(約5 x 105細胞)が含まれている場合は、それらを24ウェルプレートのフラットウェルに移します。300 μlの完全RPMI 1640培地を新しいウェルに加えます。ピペッティングを数回繰り返して、96ウェル成長クローンを再懸濁し、細胞を新しいウェルに移し、均一に分布させます。必要に応じて新しいメディアを追加します。
    1. 24ウェルプレートのウェルが細胞(約5 x 106セル)でいっぱいになったら、6ウェルプレートのフラットウェルに移します。2 mLの完全RPMI 1640培地を新しいウェルに加えます。ピペッティングを数回繰り返して24ウェルプレートに細胞を再懸濁し、新しいウェルに均一に分配します。
  10. 必要に応じてメディアを追加します。細胞を培養中に保持しない場合は、細胞を400 x gでRTで5分間ペレット化し、ELISA試験のために上清を保存します。細胞のペレットを1 x PBSで一度洗浄し、再度400 x gで5分間遠心分離し、RNA抽出まで-80°Cで乾燥させて保存します。
    1. 6ウェルプレートの細胞がコンフルエント(約20 x 106細胞)になったら、60 mmの培養プレートに移します。新しいプレートに 4 ml の RPMI 1640 培地全体を加えます。細胞を6ウェルプレートに再懸濁し、ステップ5.9および5.10で行ったように移します。
  11. 必要に応じて新しいメディアを追加します。このステップでは、90%ウシ胎児血清および10%DMSOで細胞を10〜3000万/mLで凍結します。より多くの細胞が必要な場合は、より大きな表面プレートでクローンの増殖を続けてください。

6. IgG抗体検出のためのELISA

  1. コーティングバッファーで1,200に希釈したヤギF(ab)2抗ヒトFc抗体のELISAプレートに50 μl/ウェルを分注します。コーティングバッファーは、50 mMの炭酸ナトリウム(Na2CO3)pH 9.6を含有しています。
  2. プレートをプラスチックステッカーで密封し、37°Cで1時間インキュベートします。または、4°C O/Nでインキュベートします。
  3. 各ウェルを200 μlの洗浄バッファーで6回洗浄します。洗浄バッファーには、1 x PBSに0.05%のTween-20が含まれています。抗体が結合したウェル表面に触れたり、引っ掻いたりしないでください。
  4. ブロッキングバッファー付きブロック、100 μl/ウェル。ブロッキングバッファーには、PBSに4%の脱脂粉乳が含まれています。プレートを密封し、37°Cで1時間インキュベートします。
  5. 洗わないでください。ブロッキングバッファーを捨て、プレートをペーパータオルで逆さまに3回叩いて、残留液体を取り除きます。
  6. クローンの上清と標準液をインキュベートします。
    1. 最初の試験では、ステップ5.6または5.7 1/3で得られたクローン上清をRPMIで希釈します。RPMI培地ヒトIgG溶液で希釈した標準試料の場合、1,000 ng/ml、500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.6 ng/ml、ブランクが得られます。50 μl/ウェルを使用し、37°Cで60分間インキュベートしてください。クローンの上清をさらに希釈して分析し、抗体の親和性(1/10や1/100など)をテストします。
  7. 手順6.3で行ったように洗ってください。
  8. インキュベーションバッファーに1:20,000に希釈したヤギF (ab)2抗ヒトIgG Fcペルオキシダーゼ標識50 μl/ウェルを使用してください。インキュベーションバッファーには、1x PBS中に1%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.02%Tween 20が含まれています。37°Cで60分間インキュベートします。
  9. 手順6.3で行ったように洗ってください。
  10. 0.1% 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン (TMB) を含む100 μl/ウェル基質溶液を添加します。ウェル内に安定した青色が形成されるまで10分間インキュベートします。注意してください;あまり長く待たないでください!
  11. 2 M硫酸 (H2SO4) 50 μlを加えて反応を停止します。反応停止後30分以内に、450nmでの吸収を測定してください
    注:ブランクの上に3標準偏差を持つすべてのクローンの上清は、IgGヒト抗体に対して陽性と見なされます。陽性クローンを確認するために、このELISAを同じクローンの異なる上清で少なくとも3回繰り返す必要があります。また、非特異的な交差反応性の可能性を捨てるために、上清がコーティングされていないがブロックされたウェルでインキュベートされるときにシグナルがないことを保証することをお勧めします。このステップでは、セクション7に進む前に、目的の抗体の抗原特異性をスクリーニングする検出アッセイを実施することができます。

7. 産生IgGクローンのRNA単離と一本鎖相補的DNA(cDNA)合成

  1. ELISAによりIgGの産生が確認されたら、すぐにクローンのRNAを抽出します。
  2. ステップ5.7または5.9で増殖する細胞からRNAを抽出するには、10,000個の細胞から1つの細胞にDNAを取得できる上付き文字III細胞直接cDNA合成キットを使用します。
  3. 大量の細胞から、またはステップ5.11で保存したペレットからRNAを抽出するには、高純度RNA単離キットを使用します。このステップでは、他のRNA抽出システムも適している可能性があります。製造元の指示に従ってください。
  4. 1 x 106 と 1 x 104 の間のセル番号の場合は、製造元の指示に従って逆転写システムを使用します。一本鎖cDNA合成のための他のシステムもまた使用することができます。

8. IgG産生B細胞クローンの重鎖および軽鎖の増幅のための1回目および2回目のPCR

  1. ステップ5.6および5.7で取得し、ステップ6でIgG ELISAで陽性とした細胞クローンのcDNAを用いて、表1にリストされているプライマーを用いてPCRを行う。
  2. IgGヘビー、κ、ラムダ鎖ごとに独立したPCRを設定します。フォワードプライマーとリバースプライマーを等濃度で混合したストック溶液を作製します。それらを0.4 μMの最終濃度で反応に加えます。
  3. 1 μlのcDNA合成を使用して、1ST PCRを行います。ここでは、Takara Taqの製造元の指示書を使用して20 μlの反応を行います。または、他のポリメラーゼを使用します。
  4. 1st PCRを以下のサイクル条件で行ってください:94°Cで5分間;(50サイクル:94°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで45秒、72°Cで7分間、4°Cで冷まします。反応にブランクを含めて、汚染の可能性を検出します。
  5. 1x TBE (89 mM トリスホウ酸塩と 2 mM EDTA) を調製します。1x TBE100mlの容量に、1gのアガロース(1%アガロースゲル)を加えます。アガロースが溶解するまで、電子レンジで溶液を約1分間加熱します。次に、10 mg/mlのエチジウムブロマイド (または同等のDNA色素) 4 μlを加えて混合します。
    1. 内容物をトレイに注ぎ、重合するまで待ちます。PCRミックスをゲル中で5 μl泳ぎ、バンドを可視化します。重鎖フラグメントは約400〜550 bp、軽鎖フラグメントは約300〜400 bpです。バンドが検出されない場合は、同様に2nd PCRに進みます。
  6. 1つ目のPCRミックス1 μlを使用して、2つ目のPCRを行います。ステップ8.2と同じ試薬を使用しますが、適切なプライマー混合物を使用します(表1を参照)。2回目のPCRでは、次の条件を使用します:94°Cで5分間;(50サイクル:94°Cで30秒、56.5°Cで30秒、72°Cで55秒);72°Cで7分間;4°Cで冷まし、反応にブランクを含めて、PCRコンタミネーションの可能性を検出します。
  7. 8.5で説明されているようにアガロースゲルを調製します。8.5.1のようにゲルを泳動してPCR産物を可視化します ステップ9でクローニングに適したサイズのフラグメントを含む増幅を使用し、ステップ10で抗体を作製します。
  8. 100 ngの2nd PCR、0.2 μMのプライマーまたはプライマーミックス、1 μlのターミネーター、および1 μlのバッファーを含む10 μlの反応液を使用して、DNAのシーケンシングを行います。以下の条件下でシーケンシング反応を行います（(96°Cで10秒間、50°Cで5秒間、60°Cで4分間の25サイクル)。60°Cで7分間;4°Cで冷まします。
  9. メーカーの指示に従って、マイクロスピンG50カラムでシーケンシング反応を精製します。前述のように、ライゲーションの配列を自動シーケンスアナライザーで評価します。エレクトロフェログラムはクリーンで、単一の免疫グロブリン配列に対応している必要があります。
    注:PCR産物が不透明または混合した免疫グロブリン配列を示している場合は、TopoTAシステムを使用してそれらをクローニングし、単離された配列を取得してからステップ9に進むことを検討してください。

>9. IgGクローンの重鎖と軽鎖のクローニングとシーケンシング

  1. ベクターpFUSE2ss-CLIg-hk、pFUSE2ss-CLIg-hl2、およびpFUSEss-CHIg-hG1のDNA1 μgを調製します。
  2. これらのベクターを適切な制限酵素で消化します。pFUSE2ss-CLIg-hk には EcoRI と BsiWI、pFUSE2ss-CLIg-hl2 には EcoRI と AvrII、pFUSEss-CHIg-hG1 には EcoRI と NheI を使用します。ベクターのDNA1 μgに対して、各制限酵素3ユニットを使用します。
    1. 1つの酵素で消化し、PCR精製キットで消化産物を精製します。2番目の酵素で消化し、ゲル抽出キットで精製します(メーカーのプロトコルに従って)。アガロースゲルから目的のフラグメントを切り取ります。ステップ8.5のようにアガロースゲルを調製します。
  3. 作製IgGクローンの2番目のPCR産物(κ鎖増幅用のEcoRIおよびBsiWI、ラムダ鎖増幅用のEcoRIおよびAvrII、重鎖増幅用のEcoRIおよびNheI)を分解します。1つの酵素で消化し、PCR精製キットで消化産物を精製します。2つ目の酵素で消化し、PCR精製キットで消化産物を精製します。ステップ9.2と同じ酵素の単位とDNA量を使用します。
  4. ベクター内のPCRフラグメントをT4 DNAリガーゼ16°C O/Nでライゲーションします。使用する比率は 1 : 2 (ベクトル : 挿入) にする必要があります。
  5. ライゲーション1μlを使用してDH5α細菌を形質転換します。DH5αメーカーの条件に従って変形してください。使用するベクターの種類に応じて、ブラストサイジンまたはゼオシンプレートに細菌を広げます。プレートO/Nを37°Cでインキュベートします。
  6. 単一コロニーを増殖させ、メーカーの指示に従ってミニプレップキットでDNAを抽出します。単一コロニーの成長とDNA抽出には、メーカーのDNAミニプレップキットからの推奨事項を使用します。ステップ9.2および9.3のように、ベクターおよびインサートの調製に使用した酵素を用いて消化することにより、それらを分析します。
  7. ステップ8.8および8.9で行ったように、100 ngのベクターを使用してDNAのシーケンシングを行います。

10. HEK細胞における抗体の産生

  1. 10%ウシ胎児血清、1%L-グルコース、1%ペニシリン/ストレプトアビジン(DMEM+)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でHEK細胞を150 mm細胞培養プレートで75%のコンフルエント度まで増殖させます。フードステップ10.1〜10.7で実行します。
  2. トランスフェクションの前に、以前と同様に中程度から中程度に交換しますが、子牛胎児血清は使用しません。
  3. 重鎖、軽鎖トランスフェクションごとに、2.5 mLのDMEM(血清なし)、9 μgの重鎖付きベクター、6 μgの軽鎖付きベクター、および100 μlのポリエチレンイミン(PEI)溶液(1 μg/μlストックから)とのトランスフェクションミックスを調製します。室温で15分間インキュベートします。
  4. ステップ10.3で調製したトランスフェクションミックス2.5 mLをプレート内のHEK細胞に穏やかに加えます。プレートを揺り動かして均一に分散させます。
  5. インキュベーター内で細胞を37°Cで5%CO2とともに24時間インキュベー
    6. トします。
  6. 培養液をウシ胎児血清を含まない培地に変更します。
  7. 4日後にプレートから培地を回収します。
    注:培地中の抗体は、in vitroおよびin vivoでの反応性を特徴付けるために使用できます。

>表 1.プライマー使用。

の ) の ) の )
1st PCRプライマー
フォワード (5'-3')リバース(3'-5')
IgGの5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
5フィートL-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5フィート L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5フィートL-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG3フィート Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTCTG
5'パンVκATGACCCAGWCTCCCABYCWCCCTG
λ5フィート L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG3フィート Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
5フィート L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5フィート L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
5フィート L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5フィート L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
5フィート L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd PCRプライマー
フォワード (5'-3')リバース(3'-5')
IgH5 'EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG
TGCAGの		3'NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT
ガッカグ
5′ EcoRI VH1 から 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
GTGCAGの		3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA
CCATTGの
5フィートEcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
GTGGAG		3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGTG
ACCGTGの
5フィートEcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT
GTTGGAG(グティガグ
5フィートEcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GCAGGAG
5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC
アグチャグト
5フィートEcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT
GGTGCAG(ググトカグ)
5フィート EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT
GGTACAG(ググタカグ
5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GGTGGAG ググトガグ
5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT
GGTGGAG ググトガグ
5フィートEcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT
GCAGGAG
5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT
GCAGCAGの
κ5'エコRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA
CCCAGTCの		3′ BsiWI Jκ 1 to 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC
CCAGTCT(英語		3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG
CTTGGTCの
5フィート EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA
CCCAGTCの		3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT
TTGGTCの
5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA
CCCAGACの
5フィート EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG
ACTCAGTCの
5フィート EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA
CTCAGTCの
5フィート EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG
ACACAGTCの
5フィート EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG
ACGCAGTCの
5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA
CGCAGTCTの
5フィート EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG
ACCCAGTCの
λ5インチ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT
ガッキャグ		3′ AvrII Jλ 1 to 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT
TGGTCCCの
5インチ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC
TGACTCAGの		3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC
TGGTTCC(英語)
5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC
TGACWCAGの		3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC
TCGGTCCC
5′ EcoR1 Vλ 4 to 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG
CTGACTCAの		3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT
GGGTGCC (英語)
5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC
TGACTCAGの		3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC
TTGGTCCAT
5′ EcoR1 Vλ 7 to 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG
GTGACYCAG

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

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Histopaque-1077 シグマ・アルドリッチ10771ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含む溶液
FACSAria II セルソーター BDバイオサイエンス
96 U底マイクロウェルプレート 共演者3799
アドバンスドロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム ギブコ、ライフテクノロジーズ〒12633-020
B95-8細胞株の30%v/v EBV含有上清 ATCCのCRL-16123.4 x 108部/ml
CPG2006インビボゲンオディン7909
Wi38セル シグマ・アルドリッチ90020107
インターロイキン-2ロシュ 10799068001
ELISAプレートGreiner Bio-One、マイクロロン655092
AffiniPure F(ab')2 フラグメントヤギ抗ヒト IgG、Fcγ フラグメント特異的 (非標識)ジャクソン免疫研究〒109-006-008
4%無脂肪粉乳(ブロッティンググレードブロッカー) バイオラッド〒170-6404
ヒトIgG シグマイ2511HUMAN IgG精製免疫グロブリン、5.6 mg/ml
ヤギF(ab)2抗ヒトIgG Fcγ(ペルオキシダーゼ(PO)と結合)ジャクソン免疫研究〒109-036-008
ELISAリーダー(Perkin Elmer 2030) パーキン・エルマー 〒2030-0050
ペルオキシダーゼ標識 AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5μ ジャクソン免疫研究〒309-035-095
SuperScript III細胞直接cDNA合成システム インビトゲン 18080-200
Applied Biosystems(ABI)GeneAm PCRシステム2700応用バイオシステム
高純度RNA単離キット ロシュ11828665001
逆転写システムキット プロメガA3500
組換え Taq DNA ポリメラーゼタカラR001Aの
プライマー(2μl)シグマ
超高純度アガロース インビトゲン16500-500
100 bpラダーインビトゲン15628-019
数量1 4.5.2 (Gel Doc 2000)バイオラッド〒170-8100
QIAquick PCR精製キットキアゲン28106
BigDye Terminator v3.1 サイクルシーケンシングキット 応用バイオシステム4337455
0.1 mL 反応プレート (MicroAMP Optical 96-well)応用バイオシステム4346906
遺伝子分析装置 ABI300 応用バイオシステム4346906
DH5αコンピテントセル(大腸菌)インビトゲン18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)インビボゲンPFUSESS-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) インビボゲンPFUSESS-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)インビボゲンPFUSE2SS-HCLK
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) インビボゲンPFUSE2SS-HCLL2
SOC媒体インビトゲン15544-034
ゼオシンを添加したLBベースの寒天培地(Fast-Media Zeo Agar)インビボゲンFAS-ZN-S
テリフィックブロス(TB)ベースの液体培地にゼオシン(Fast-Media Zeo TB)を添加インビボゲンFAS-ZN-Lの
DNA Miniprepキット オメガバイオテクノロジーD6942-02
Nanodrop (ND1000 分光光度計)ナノドロップ
ブラストシジンを添加したLBベースの寒天培地(Fast-Media Blast Agar)インビボゲンFAS-BL-Sの
テラフィックブロス(TB)ベースの液体培地にブラストシジンを添加(Fast-Media Blast TB)インビボゲンFAS-BL-Lの
エコRIニューイングランドバイオラボR0101Sの20,000 U/ml、10x NEBuffer EcoRI溶液
ンヘイニューイングランドバイオラボR0131Sの10,000 U/ml、10x NEBuffer 2.1 中
2-Log DNAラダーニューイングランドバイオラボN3200Sの0.1-10.0 kb、1,000 μg/ml
クリスマスニューイングランドバイオラボR0180Sの10,000 U/ml、10x CutSmart バッファー入り
ブシウィニューイングランドバイオラボR0553Sの10,000 U/ml、10x NEBuffer 3.1 で
アヴリIIニューイングランドバイオラボR0174Sの5,000 U/ml、10x CutSmart バッファー入り
FastAP感温性アルカリホスファターゼサーモサイエンティフィックEF06511 U/μL、10x FastAPバッファ
DH5αコンピテントセル インビトゲン18263-012
PEマウス抗ヒトIgGBDファーミンゲン555787
抗CD22、PerCP-Cy5.5、クローン:HIB22フィッシャーサイエンティフィックBDB563942
QIAprep スピン Miniprep キット キアゲン27106
BigDyeターミネーターv3.1応用バイオシステム4337455
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