メタロペプチダーゼに対するモノクローナル抗体作製ハイブリドーマ技術

要約

出典:Xia, P., et al.ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の産生。J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、従来のハイブリドーマ技術を用いて、膜結合メタロペプチダーゼであるブタアミノペプチダーゼN(APN)に対するモノクローナル抗体を産生するアッセイを実演しています。マウスにAPNを免疫すると、脾臓細胞が採取され、不死性骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマが作製されます。次に、ハイブリドーマをHAT(ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン)培地を使用して選択および増殖させ、さまざまなAPNエピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生します。

プロトコル

すべての動物モデル手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 動物の予防接種

1. 皮下(s.c)は、6〜8週齢の雌のBALB / cマウスに、50μgのAPNタンパク質またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS、陰性対照)を2週間に1回アジュバントと混合して注射します。初期免疫には、加熱死菌を含む完全なフロイントのアジュバントを使用し、ブースター免疫には不完全なフロイントのアジュバントを使用します。APNタンパク質(またはPBS)とフロイントのアジュバントまたは不完全なフロイントのアジュバントをそれぞれ等量混合します。
2. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いた間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、これらのマウスの血清中のAPNに対する抗体価を検出します。

2. APNに対するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ技術

1. 腹腔内(i.p.)に100μgのAPNタンパク質を選択したマウスに注入して、最終的な抗原ブーストを行います。
2. 3日後、ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、v / v、腹腔内)と子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
3. 脾臓を採取し、DMEMで2回洗って血液と脂肪細胞を取り除きます。200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織の破片を除去し、遠心分離(1500 × g、10分)を使用して脾臓細胞を回収して脾臓の膜を除去します。
4. 5 mLのダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を含む25 cm 2フラスコに6%ウシ胎児血清(FBS)を添加し、細胞生存率を維持するために37°C、6%_CO2雰囲気で培養する25 cm²フラスコ内の種子マウス骨髄腫SP2/0細胞。培養の5〜6日後、細胞は蘇生後に80%〜90%のコンフルエンスに達し、成長ログフェーズになります。顕微鏡下では、細胞は丸く、明るく、透明です。
5. ハイブリダイゼーションの1日前に、以前に発表された方法に従ってマウスの腹腔からマクロファージを採取します。
6. 腹膜マクロファージを0.1-0.2 × 10⁵/mLの密度で96ウェルプレートに播種し、各ウェルに100 μLのHAT培地(DMEMに10% FBSおよび1x HATサプリメントを添加)を含有し、37°C、6%_CO2加湿雰囲気で一晩インキュベートします。
7. ハイブリダイゼーションのために、8〜10本のボトルからSP2/0細胞をピペットで穏やかに吸引し、10mLの無血清DMEM培地に懸濁します。細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、2回遠心分離(1500 × g、10分)した後、10 mLのDMEMに再懸濁します。
8. 定量した脾臓細胞とSP2/0細胞を10:1の比率で混合し、50 mLチューブに移します。遠心分離(1500 × g、10分)し、上清を捨てます。チューブの底に細胞ペレットを採取し、手のひらで軽くたたいてペレットを緩めてからハイブリダイゼーションします。
9. 37°Cに予熱したポリエチレングリコール1500(PEG 1500)1 mLを、緩めた細胞ペレットにスポイトを使用して45秒間滴下し、チューブの底を静かに回転させます。
10. 上記の混合物に37°Cに予熱したDMEM1 mLを90秒間ゆっくりと加え、続いてさらに30 mLの新鮮なDMEMを加えます。フュージョンチューブを37°Cのウォーターバスに30分間入れます。
11. 温浴でのインキュベーション後、細胞を回収し、HAT培地に再懸濁します。次に、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートで培養します。
12. 5日後、100 μLの新鮮なHAT培地を各ウェルに加え、プレートをさらに5日間インキュベートした後、培地をHT培地(DMEMに10% FBSと1x HTサプリメントを添加)に置き換えます。
13. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。
    1. 96ウェルプレートのウェル内の培地が黄色に変わった場合(細胞増殖と代謝物の放出により、培地のpHは6.8に低下し、フェノールレッドはフクシア色から黄色に変わる)、または細胞クラスターが観察されたら、選択したウェルから100 μLの上清を取得し、コーティングされたELISAプレートのウェルに添加します。マイクロプレートリーダーを使用して、OD₄₅₀の値を測定します。
    2. APNに対するポリクローナル抗体と非感染マウス血清をそれぞれ陽性および陰性のコントロールとして使用し、PBSをブランクコントロールとして使用します。この研究では、サンプルの_OD450比とネガティブコントロール(P / N)≥2.1がポジティブセレクションスタンダードとして認識されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フロイントのアジュバントを完成させる	シグマ・アルドリッチ	F5881	動物免疫
DMEM	ギブコ	11965092	細胞培養
DMEM-F12	ギブコ	12634010	細胞培養
強化セルカウンティングキット-8	ビヨタイムバイオテクノロジー	C0042	細胞の生存率と活力の測定
ウシ胎児血清	ギブコ	10091	細胞培養
ジェネチシン™選択的抗生物質	ギブコ	11811098	選択的抗生物質
HATサプリメント(50倍)	ギブコ	21060017	セル選択
HTサプリメント(100X)	ギブコ	11067030	セル選択
不完全なフロイントのアジュバント	シグマ・アルドリッチ	F5506	動物免疫
マイクロプレートリーダー	ビオテック	ボックス998	ELISA分析
ポリエチレングリコール1500	ロシュ・ダイアグノスティック	10783641001	細胞融合
96ウェルマイクロプレート	コーニング	3599	細胞培養

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