メタロペプチダーゼに対する組換え抗体の作製法

要約

出典:Xia, P. et al., ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の産生。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、メタロペプチダーゼに対する組換え抗体の産生手順を示しています。抗体、緑色蛍光タンパク質、および抗生物質耐性の遺伝子を保有する組換えプラスミドを、リポフェクタミンで上皮細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションした細胞を選別し、培養して組換え抗体を作製します。

プロトコル

1. ブタアミノペプチダーゼN(APN)タンパク質抗原の調製

>注:pET28a(+)-APN-BL21(DE3)株とAPN安定発現細胞pEGFP-C1-APN-IPEC-J2は、以前の研究で構築されました。

1. 凍結したグリセロールストックから細菌を回収し、50 μg/mL カナマイシン(Km⁺)を含むLuria-Bertani(LB)プレートにストリークして、シングルコロニーを単離します。
2. 縞模様のフレッシュプレートから1つのコロニーを選択し、4 mLのLB培地(10 g/Lトリプトン、10 g/L塩化ナトリウム(NaCl)、5 g/L酵母抽出物、pH 7.2)で培養し、Km⁺(50 μg/mL)を添加し、37°Cで攪拌(178 rpm)しながら一晩(12-16時間)増殖させます。
3. 調製した細菌を新鮮なKm⁺ LBブロスで1:100で希釈し、OD₆₀₀が0.4〜0.6に達するまで2〜3時間振とうしながら37°Cでインキュベー
トします。
4. イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を培地に添加して最終濃度0.4 mMにし、培養物を16°Cでさらに10時間インキュベー
トします。
5. したがって、IPTG誘導(10,000 × g、4°C、15分)を使用して細菌を遠心分離し、回収します。
6. 1 mg/mL リゾチームを含む 5 mL の LEW (Lysis/Equilibration/Wash) バッファー (50 mM 無水リン酸ナトリウム 1塩基 (NaH₂PO₄) および 300 mM NaCl、pH 8.0) を使用して、細胞ペレットを再懸濁します。細菌懸濁液を氷上で30分間攪拌し、超音波ホモジナイザーを使用して完全に(15秒パルスおよび20秒オフ、15分)超音波処理します。
7. 粗細胞ライセートを4°Cおよび10,000 × gで30分間遠心分離し、細胞破片を除去します。上清を予め平衡化したカラムに移し、重力ドレナージの1〜2分前にインキュベートします。この手順を 3 回繰り返します。
8. 20 mLのLEWバッファーを使用してカラムを洗浄し、重力を使用して排出します。9 mLの溶出バッファー(50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaClおよび250 mMイミダゾール、pH 8.0)を使用してヒスチジンタグ付きAPNタンパク質を溶出し、透析チューブに回収します。
9. 炭酸ナトリウム-重炭酸ナトリウム(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、135 mM NaCl、4.7 mM塩化カリウム、2 mM NaH₂PO₄、および10 mMドデカドレートリン酸ナトリウム二塩基性、pH 7.2)緩衝液中で、タンパク質溶液を4°Cで一晩透析します。
10. 12.0% SDS-PAGEゲルとウェスタンブロッティングを使用して分析し、APNタンパク質の純度を評価します。
    1. ゲルの各ウェルに5 μgのタンパク質をロードし、110 Vで1.5時間泳動させます。次に、タンパク質をポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに15 Vで50分間移し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用して精製タンパク質の濃度を決定します。

2. 動物の予防接種

1. 皮下(s.c)は、6〜8週齢の雌のBALB / cマウスに、50μgのAPNタンパク質またはPBS(ネガティブコントロール)を2週間に1回アジュバントと混合して注射します。初期免疫には、加熱死菌を含む完全なフロイントのアジュバントを使用し、ブースター免疫には不完全なフロイントのアジュバントを使用します。APNタンパク質(またはPBS)とフロイントのアジュバントまたは不完全なフロイントのアジュバントをそれぞれ等量混合します。
2. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いた間接酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、これらのマウスの血清中のAPNに対する抗体価を検出します。

3. APNに対するモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ技術

1. 腹腔内(i.p.)に100μgのAPNタンパク質を選択したマウスに注入して、最終的な抗原ブーストを行います。
2. 3日後、ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg、v / v、腹腔内)と子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
3. 脾臓を採取し、ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)で2回洗って血液と脂肪細胞を取り除きます。200メッシュの銅グリッドを使用して脾臓細胞懸濁液をろ過して組織の破片を除去し、遠心分離(1500 × g、10分)を使用して脾臓細胞を回収して脾臓の膜を除去します。
4. 5 mLのDMEMを添加した25 cm 2フラスコに6%ウシ胎児血清(FBS)を添加し、細胞生存率を維持するために37°C、6%二酸化炭素(CO₂)雰囲気で培養する25 cm²フラスコにマウス骨髄腫SP2/0細胞を播種します。培養の5〜6日後、細胞は蘇生後に80%〜90%のコンフルエンスに達し、成長ログフェーズになります。顕微鏡下では、細胞は丸く、明るく、透明です。
5. ハイブリダイゼーションの1日前に、以前に発表された方法に従ってマウスの腹腔からマクロファージを採取します。
6. 腹膜マクロファージを0.1-0.2 × 10⁵/mLの密度で96ウェルプレートに播種し、各ウェルには100 μLのヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)培地(DMEMに10% FBSおよび1x HATサプリメントを添加)を含有し、37°C、6%_CO2加湿雰囲気で一晩インキュベートします。
7. ハイブリダイゼーションのために、8〜10本のボトルからピペットでSP2/0細胞を穏やかに吸引し、10 mLの無血清DMEM培地に懸濁します。細胞を新鮮なDMEMで洗浄し、2回遠心分離(1500 × g、10分)した後、10 mLのDMEMに再懸濁します。
8. 定量した脾臓細胞とSP2/0細胞を10:1の比率で混合し、50 mLチューブに移します。遠心分離(1500 × g、10分)し、上清を捨てます。チューブの底に細胞ペレットを採取し、手のひらで軽くたたいてペレットを緩めてからハイブリダイゼーションします。
9. 37°Cに予熱したポリエチレングリコール1500(PEG 1500)1 mLを、緩めた細胞ペレットにスポイトを使用して45秒間滴下し、チューブの底を静かに回転させます。
10. 上記の混合物に37°Cに予熱したDMEM1 mLを90秒間ゆっくりと加え、続いてさらに30 mLの新鮮なDMEMを加えます。フュージョンチューブを37°Cのウォーターバスに30分間入れます。
11. 温浴でのインキュベーション後、細胞を回収し、HAT培地に再懸濁します。次に、腹膜マクロファージを接種した96ウェルプレートで培養します。
12. 5日後、100 μLの新鮮なHAT培地を各ウェルに加え、プレートをさらに5日間インキュベートした後、培地をHT培地(DMEMに10% FBSと1x HTサプリメントを添加)に置き換えます。
13. 0.05 M PBS(pH 9.6)で希釈した5 μg/mL APNタンパク質でコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ELISAアッセイを使用してハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体を分析します。
    1. 96ウェルプレートのウェル内の培地が黄色に変わった場合(細胞増殖と代謝物の放出により、培地のpHは6.8に低下し、フェノールレッドはフクシア色から黄色に変わる)、または細胞クラスターが観察されたら、選択したウェルから100 μLの上清を取得し、コーティングされたELISAプレートのウェルに添加します。マイクロプレートリーダーを使用して、光学濃度450(OD450)の値を測定します。
    2. APNに対するポリクローナル抗体と非感染マウス血清をそれぞれ陽性および陰性のコントロールとして使用し、PBSをブランクコントロールとして使用します。本研究では、OD450サンプルのOD450比とネガティブコントロール(P/N)≥2.1がポジティブセレクションスタンダードとして認識されました。
14. 3回連続してポジティブセレクションラウンドを行った後、APNタンパク質に対する血清学的反応の増加を示すハイブリドーマを選択し、限定的な希釈アッセイを行います。
    1. 腹膜マクロファージを調製し、前述のように96ウェルプレートで播種します。
    2. ハイブリドーマ細胞をHT培地にウェルあたり平均0.5〜2細胞で懸濁し、37°C、6%_CO2インキュベーターで培養します。ELISAイムノアッセイで示される陽性率が100%に達するまで、この手順を3〜4回繰り返します。
15. 連続的な凍結融解の圧力の下で、抗APN抗体を安定して分泌し、正常に増殖できる陽性のハイブリドーマ細胞を選択します。
    1. 各マウスに0.3mLのプリスタンを単回注射します(8〜10週間)。原石投与後10日後に、各マウスに2-5 x 10⁵ハイブリドーマ細胞を0.5 mLのPBS(pH 7.2)に注入します。
    2. 注射の8〜10日後に、これらのマウスの腹腔から腹水を注意深く採取します。
    3. 上清を5,000 × gで15分間遠心分離して回収し、33%飽和硫酸アンモニウム[(NH₄)₂SO₄]沈殿物とプロテインAアガロースを使用して上清中の抗体を精製します。

4. APNタンパク質に対するモノクローナル抗体(mAb)のキャラクタリゼーション

1. SBA Clonotyping System-HRPを使用して、採取したmAbの免疫グロブリンサブタイプを決定します。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを使用して、mAbの純度と特異性を評価します。
2. ELISAを使用してAPNタンパク質に対するmAbエピトープ特異性を解析します。加法性値(AV)は、OD_{モノクローナル抗体(a+b)}と(OD_mAbs-a+OD_mAbs-b)の比率であり、モノクローナル抗体が同じ抗原部位を認識するかどうかを評価するために使用されます。OD_mAbs-a と OD_mAbs-b は、APN のみに対するさまざまなモノクローナル抗体の OD450 値を表し、OD_mAbs(a+b)は、APN に対する 2 mAb の 1:1 混合物の OD450 値を表します。
   1. 各サンプルを少なくとも 4 回の繰り返しで評価し、実験全体を少なくとも 3 回繰り返します。

5. APNに対するrAbの表現

1. 上記のAPN免疫マウス(TRIzolなど)のハイブリドーマ細胞および脾臓から全RNAを抽出します。メーカーの指示に従って、cDNA合成キットを使用して相補的DNA(cDNA)を合成します。
2. ネストされたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してmAbの可変領域を増幅し、シーケンシングを使用して重鎖(VH)および軽鎖(VL)配列を決定します。IMGTマウスゲノム解析ツール(http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php)を用いて、VHとVLをコードする遺伝子を解析します。
3. VH遺伝子とVL遺伝子をリーダー配列と組み合わせ、シームレスクローニング技術を用いてそれぞれpET28a(+)ベクターとpIRES2-ZsGreen1ベクターに逐次サブクローニングすることで、DNA断片を瘢痕なく挿入することができます。特定のプライマーを表1に示します。
4. pET28a (+)-rAbs-APN-BL21形質転換細菌を、オービタルシェーカー中の0.4 mM IPTG存在下、37°Cで10時間増殖させます。次に、ルーチンのタンパク質精製を使用して、rAbsタンパク質の発現を誘導、精製、および評価します。
5. 1ウェルあたり100 μL 0.5 x 10⁵ CHO細胞を96ウェルプレートに播種し、6% CO₂雰囲気で37°Cで18〜24時間インキュベートします。細胞が80-90%のコンフルエンスに達したら、pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミドをOpti-MEMで最終濃度0.1 μg/μLに希釈し、トランスフェクションに使用する前に室温で5分間インキュベートします。
6. 希釈したpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APNプラスミド50 μLを1 μLのLipofectamine 2000およびOpti-MEM49 μLと穏やかに混合し、室温でさらに20分間インキュベートします。CHO細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの混合物を加え、6% CO₂雰囲気中で37°Cで4〜6時間インキュベー
トします。
7. トランスフェクション後4〜6時間で、培地を10%FBSを添加したDMEM-F12培地と交換し、プレートをさらに48時間インキュベートします。次に、400 μg/mL の G418 を各ウェルに添加して、安定してトランスフェクションした細胞を選択します。
8. 10% FBSおよび400 μg/mL G418を添加したDMEM-F12培地を使用して10日間選択した後、細胞(3.0 × 10⁷細胞/mL)を蛍光活性化細胞ソーティングにより選別します。細胞集団の約10-15%が陽性であった。
9. 収穫した陽性細胞を段階希釈し、96ウェルプレートでウェルあたり平均0.5〜2細胞で播種し、37°C、6%_CO2インキュベーターで培養します。G418(200 μg/mL)による選択を使用して、安定的にトランスフェクションしたpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を維持します。
10. 上述の細胞培養培地中のFBS濃度は、対数増殖期において3週間にわたって10%から0%まで徐々に減少する。次に、接着性CHO細胞を無血清培地での懸濁液増殖に適合させます。
11. 播種したpIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO細胞を対数増殖期の無血清培地で0.8-1.0 × 10⁵細胞/mLの密度で振とうフラスコで80-110 rpmの振とう速度、37°C、6%CO₂で培養します。
12. 12時間ごとに細胞懸濁液を採取し、メーカーの指示に従って細胞計数キット(CCK-8など)を使用して細胞生存率と活力の変化を測定します。
13. 抗体発現は、細胞生存率が80%に低下し、細胞密度が10⁶細胞/mL×1.0-2.0に達するとピークレベルに達します。遠心分離法を用いて細胞上清を回収し、0.22 μmのポリテトラフルオロエチレンメンブレンフィルターを用いて濾過し、プロテインAアガロースを用いて精製します。
14. 間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いてAPN特異的抗体の産生を確認します。
15. 前述したように、ELISAアッセイを使用して抗体価と結合親和性を測定します。ソフトウェアを使用して、4パラメータのロジスティック方程式で抗体の平衡解離定数(KD値)を計算します。

>表 1.この研究で使用された特定のプライマー。

入門	シーケンス (5'-3')
VH-VL-Fの	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-Rの	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-Zsグリーン1-F	CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-Zsグリーン1-R	GGGGGGGAGGGAGGGGGGGGGGGGGGGATACCCGTATTACCC

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フロイントのアジュバントを完成させる	シグマ・アルドリッチ	F5881	動物免疫
ダピ	ビヨタイムバイオテクノロジー	C1002	核対比染色
DMEM	ギブコ	11965092	細胞培養
DMEM-F12	ギブコ	12634010	細胞培養
Dylight 549標識ヤギ抗マウスIgG二次抗体	アバカイン	A23310 (英語)	間接免疫蛍光分析
強化セルカウンティングキット-8	ビヨタイムバイオテクノロジー	C0042	細胞の生存率と活力の測定
ウシ胎児血清	ギブコ	10091	細胞培養
ジェネチシン™選択的抗生物質	ギブコ	11811098	選択的抗生物質
HATサプリメント(50倍)	ギブコ	21060017	セル選択
HTサプリメント(100X)	ギブコ	11067030	セル選択
不完全なフロイントのアジュバント	シグマ・アルドリッチ	F5506	動物免疫
イソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド	シグマ・アルドリッチ	I5502	タンパク質発現
カナマイシン	ビヨタイムバイオテクノロジー	ST102	殺菌性抗生物質
Leica TCS SP8 STED 共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	SP8 性感染症	蛍光イメージング
リポフェクタミン® 2000 試薬	サーモフィッシャー	11668019	トランスフェクション
LSRFortessa™蛍光活性化細胞ソーティング	BDの	FACS LSRFortessa	フローサイトメトリー
マイクロプレートリーダー	ビオテック	ボックス998	ELISA分析
マイクロ分光光度計	サーモフィッシャー	ナノドロップワン	核酸濃度検出
NaCl	Sinopharm化学試薬	10019308	培養液
(NH4)2SO4	Sinopharm化学試薬	10002917	培養液
オプティMEM	ギブコ	31985088	細胞培養
ポリエチレングリコール1500	ロシュ・ダイアグノスティック	10783641001	細胞融合
PrimeScript™ 1st strand cDNA 合成キット	タカラバイオ	RR047	リアルタイムqPCR
プロテインAアガロース	ビヨタイムバイオテクノロジー	P2006	抗体タンパク質の精製
Protino® Ni+-TED 2000 パックドカラム	マシェリー・ナーゲル	745120.5	タンパク質精製
SBAクロノタイピングシステム-HRP	サザンバイオテクノロジー	00年5月	マウスモノクローナル抗体のアイソタイピング
シームレスクローニングキット	ビヨタイムバイオテクノロジー	D7010Sの	プラスミドの構築
シェイクフラスコ	ビヨタイムバイオテクノロジー	E3285	細胞培養
炭酸ナトリウム-重炭酸ナトリウム緩衝液	ビヨタイムバイオテクノロジー	C0221A(英語)	細胞培養
トランスブロットSDセミドライトランスファーセル	バイオ・ラッド	〒170-3940	ウェスタンブロット
トリプトン	オキソイド	LP0042	培養液
超音波ホモジナイザー	寧波新芝バイオテクノロジー	JY92-IIN	サンプルの均質化
酵母エキス	オキソイド	LP0021	培養液
96ウェルマイクロプレート	コーニング	3599	細胞培養

の の の の ス 年度 名