抗体によるFc受容体活性化を研究するためのIn vitro人工活性化アッセイ

要約

出典:Petriello, A. et al.治療用抗体の存在下でのFcγRIIIa関与によって引き起こされるヒトナチュラルキラー細胞イベントの評価。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、ヒトナチュラルキラー細胞の治療用抗体によって開始されるFcγRIIIa駆動型イベントを示しています。この人工刺激プラットフォームは、細胞骨格の再構成、脱顆粒、ケモカイン/サイトカイン産生、および結合に関与する抗体のFcγRIIIaおよびFc部分によって媒介されるシグナル伝達経路を含む、下流のエフェクター機能の探索を容易にします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. PBMCの単離とNK細胞の濃縮・精製

>注:末梢血単核細胞(PBMC)の単離および濃縮/精製のための他の方法も実行できます。

1. ヘパリンを含むチューブに、調整された条件下で200mLの血液を採取します。
2. 15 mLの密度グラジエント培地を、多孔質バリアを組み込んだ50 mLチューブに加えます。チューブを1000 x gで30秒間回転させます。
3. チューブに12.5mLの血液を加え、続いてPBSの別の12.5mLを加え、3倍に静かに反転させます。
4. 細胞が回転している間、多孔質バリアを備えた各チューブに40 mLのPBSを含む50 mLのコニカルチューブを準備します。
5. チューブを慎重に取り外し、遠心分離後に点検します。50 mLチューブの20 mLと25 mLの境界の間、多孔質バリアの上にあるPBMCの薄くて目に見える白い層を確認します。
6. 薄くて白いPBMC層を乱さないように、ピペットを使用して上部からできるだけ多くの液体を慎重に取り除きます。
7. 清潔な10 mLの血清ピペットで、透明で黄色がかった透明な液体層に加えて、PBMC層をチューブのフィルターまで静かに取り除きます。
8. PBMCと液体を、ステップ1.4で調製したPBSを含む50mLコニカルに排出します。RTおよび300 x gでチューブをスピンし、5分間
。
9. PBS洗浄液を吸引し、さらに40mLのPBSを加えます。RTおよび300 x gでチューブをスピンし、5分間
。
10. 洗浄後、細胞をカウントし、1 x 10⁷細胞あたり40 μLの2% BSA/PBSに再懸濁します。
11. 選択した方法を使用してNK細胞の単離に進みます。選択肢には、手動または自動の磁気ビーズベースの選別が含まれます。蛍光活性化細胞の選別も行うことができます。
12. 細胞の少量アリコートを除去して、フローサイトメトリーによりNK細胞の純度を決定します。ゲーティング戦略には、前方散乱光と側方散乱光プロファイルに基づいて生細胞をゲートし、次に特定の生集団のNKマーカー(CD3、CD56など)に基づいて純度を評価する方法が含まれます。典型的な純度は>95%です。
13. 単離が完了したら、細胞を室温および300 x gで5分間スピンし、ペレット化して吸引します。
14. 細胞ペレットを、栄養素、10%熱不活化FBS、1 mMピルビン酸ナトリウム、55 mM 2-ME、および10 mM HEPES(pH = 7.2)を含むRPMI 1640中の1 x 10⁷細胞/mLに再懸濁します。

>2. FcγRIIIaを介したNK細胞の抗体を介した活性化

1. 冷蔵マイクロ遠心分離機を4°Cに設定します。
2. 再懸濁したNK細胞1 x 10⁶(100 μL)を1.5 mLチューブに分注し、氷上に置きます
   手記： 細胞は、多数のサンプルがある場合、96ウェルU底プレートに分注することができます。
3. サンプルあたり100 μg/mLのリツキシマブ(または目的の抗体)を1 μL調製し、1 μLを細胞に加えて最終濃度1 μg/mLの抗体
   手記：この時点またはそれ以前に他の分子を細胞に添加して、組み合わせ効果の評価を行うことができます。ここでは、リチクスマブを刺激に使用しました。これまでの研究では、低分子阻害剤が刺激剤に加えられてきました。
4. サンプルを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、サンプルあたり50 μg/mLの抗ヒトκ軽鎖抗体を培地に調製し、ヒートブロックまたはウォーターバスで37°Cに温めます。
5. 氷上で細胞をインキュベートした後、1 mLの氷冷培地を加え、135 x gで4°Cで5分間遠心し、1 mLの氷冷培地で再度洗浄します。
6. 最後の洗浄後に上清を吸引し、ステップ2.4で調製した抗ヒトκ軽鎖混合物50μLを加えます。
7. エンドユーザーが決定したタイムポイントで、37°Cのヒートブロックまたはウォーターバスでサンプルを直ちにインキュベートします。
8. 1 mLの氷冷培地を加えて刺激を停止し、すぐに冷蔵遠心分離機で135 x gで5分間サンプルを回転させ、1 mLの氷冷培地でもう一度洗浄します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16% パラホルムアルデヒド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	50-980-487
Alexa Fluor 488ファロイジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12379 (英語)
抗マウスHRP抗体	細胞シグナル伝達技術	7076
AutoMACSインストゥルメント	ミルテニー		NK細胞単離法;別の単離装置を使用してもよい
CD107a APC抗体	バイオレジェンド	328620
ウシ血清アルブミンフラクションV、脂肪酸フリー	ミリポアシグマ	10775835001
サイトカイン30-Plexヒトパネル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LHC6003M	ケモカイン/サイトカイン法;別のケモカイン/サイトカイン分析法を使用してもよい
FBS(ウシ胎児血清)	ハイクロン	01 SH30071月
ヤギ反ヒトκ軽鎖 抗体	ミリポアシグマ	AP502
HALTプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78440
pAKT (S473) 抗体	細胞シグナル伝達技術
pERK1/2	細胞シグナル伝達技術
pPRAS40抗体	細胞シグナル伝達技術	13175
β-アクチンHRP抗体	アブカム	AB6721
NK細胞単離キット	ミルテニー	〒130-092-657	NK細胞単離キット;別の単離キットを使用してもよい

名 の 抗体