抗原特異的B細胞からモノクローナル抗体を作製する技術

要約

出典: Devilder, M., et al. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood . J. Vis. Exp. (2018年)。

抗原特異的なB細胞からモノクローナル抗体を作製する技術を実演しています。単離された抗原特異的B細胞からクローニングされた抗体の重鎖と軽鎖をコードする真核生物の発現ベクターを、ポリプレックスを用いて哺乳動物細胞に導入します。細胞内に入ると、これらのベクターは翻訳を受け、得られた重鎖ペプチドと軽鎖ペプチドが抗体に集合し、その後、細胞から分泌されます。

プロトコル

>1. モノクローナル抗体の作製

1. トランスフェクションの前日に、15,000個のヒト胚性腎臓293A(HEK 293A)細胞を、96ウェルプレートのウェルあたり10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の200μLに播種します。CO₂インキュベーター(5% CO₂)で37°Cで一晩インキュベートします。
2. 線状ポリエチレンイミン誘導体をトランスフェクション試薬として使用した 10% FBS 含有 DMEM 培地中の Cotransfect 293A 細胞
   手記：トランスフェクションを3回に分けて行います。以下のプロトコルは、平底96ウェルプレートの1ウェル用です。
   1. 0.5 μL の DNA トランスフェクション試薬を 10 μL の 150 mM NaCl に希釈します。0.125 μgの可変重鎖(vH)および0.125 μgの可変軽鎖(vL)発現ベクターを10 μLの150 mM NaClに希釈します。各希釈液を10秒間ボルテックスします。
   2. 10 μL の DNA 溶液に 10 μL の希釈した DNA トランスフェクション試薬を加えます。ボルテックス15秒で培養し、室温で15分間インキュベートします。20 μLの混合物を293A細胞に滴下し、プレートを静かに撹拌して混合します。
3. トランスフェクションの16時間後に培地を交換し、無血清培地で細胞を5日間培養します
   手記：血清免疫グロブリン(Igs)が産生された抗体を汚染しないように、無血清培地を使用してください。
4. 細胞と破片を460 x gで5分間遠心分離して
除去します。
5. マルチチャンネルピペットで吸引して上清を回収し、V底96ウェルプレートに移します。
6. 再構成酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)/酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)コーティングバッファー1x、最終濃度2 μg/mLの96ウェルELISAプレートを1ウェルあたり100 μLで4°Cで一晩コーティングします。
7. 10% FBS DMEM培地でウェルを37°Cで2時間ブロックします。
8. ステップ1.5からトランスフェクトした293A細胞の上清50μLを添加し、室温で2時間インキュベー
トします。
9. 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)酵素に結合した抗ヒト免疫グロブリンG抗体(IgG Ab)100 μLを1 μg/mLで添加し、室温で1時間インキュベートします。発色基質50μL(3,3',5,5'テトラメチルベンジジン、TMB)を加え、20分間インキュベートします。
10. 分光光度計で450nmの光学密度を読み取ります.
    手記：ELISAアッセイによって明らかになった特異的mAbsは、さらに大規模に産生し、ヒトIgGに対する親和性を示すプロテインAカラム上で精製することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HEK 293A細胞株	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R70507
DMEM (1X) ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム	ライフテクノロジーズによるギブコ	21969-035	(+) 4,5g/L D-グルコース 0,11g / Lピルビン酸ナトリウム (-)L-グリュトミン
ニュートリドーマ-SP	ロシュ	11011375001	100倍コンク
ウシ胎児血清(FBS)	ドミニク・ダッチャー	S1810-500
Jet PEI DNAトランスフェクション試薬	ポリプラス	101から40
平底96ウェルプレート	隼	353072
Vボトム96ウェルプレート	Nunc/サーモフィッシャー	55142