マウス脳への抗体の対流増強送達

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ステップカテーテルの準備

1. カテーテルのステップのための溶融シリカチューブの調製
   1. 内径0.1mm、壁厚0.0325mmのチューブの溶融シリカキャピラリーを30mmの長さに切断します。
   2. チューブに亀裂がないか調べ、マイクロフォージを使用して端部をヒートポリッシュして、チューブの開口部の表面が滑らかであることを確認します。
2. インナーチューブを金属針に固定
   1. 27 Gの針を10 μLのシリンジに取り付け、シリンジを定位ロボットにセットします。
   2. ロボットを使用して、シリンジを硬い表面上で動かし、針先で触れます。この位置は、カテーテルステップの長さを設定するための基準面として機能するため、ソフトウェアに注意するか保存する必要があります。
   3. 針を持ち上げて、溶融シリカキャピラリーを針の内側に配置できるようにします。
   4. フューズドシリカキャピラリーを針に置き、キャピラリーの20mmが針から突き出
   るようにします。
   5. ピペットを使用して、図 1 に示すように、2 μL の高粘度シアノアクリレート接着剤を、金属針からキャピラリーの下端の 10 mm 上まで、キャピラリー上に均一に広げます。
   6. 定位ロボットを使用して、金属針の先端が基準面から1mm上になるまで針を下げます。このようにして、溶融シリカキャピラリーは金属針に固定され、先端から1mmのステップを形成します。ステップが鈍くならないように、金属針の端に形成されている余分な接着剤をすべて取り除きます。
   7. 接着剤が固まるまで15分待ち、カテーテル付きのシリンジを定位ロボットから取り外します。ステップで余分な接着剤がすべて除去されたことを確認するには、カテーテルの先端を顕微鏡で確認します。
3. アガロースのブロックを使用したステップカテーテルの試験
   1. 従来のゲルトレイでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.6%アガロース溶液を調製し、重合するまで待ちます。アガロースを約20mm×20mmのブロックにカットします。使用するまで、ブロックをPBSに浸しておきます。
   2. ステップカテーテルシリンジに、ろ過されたトリパンブルーの0.4%溶液10μLを手動で充填します。
   3. 定位ロボットを使用して、1 μL を 0.2 μL/min で分注し、固定手順中のカテーテル ステップのシーリングを評価します。トリパンブルー溶液は、カテーテルの先端にのみ見える必要があります。.ペーパーティッシュで拭き取ってください。
   4. アガロースブロックを定位ロボットに配置し、カテーテルの先端がアガロースブロックの表面に対して参照されるようにロボットをキャリブレーションします。
   5. CED の注入パラメータをプログラムします。
      1. 注入量が 5 μL の場合、0.2 μL/分で 1 μL、0.5 μL/分で 2 μL、0.8 μL/分で 2 μL のステップを使用します。各ステップの持続時間を比例的に変更することにより、特定の実験計画に従って最終注入量を調整します。
      2. 溶液をマウス尾状被殻(線条体)に注入するには、ブレグマから正面1mm、横方向1.5〜2mmの位置で、深さ3.5mmでそのような注射を行います。.
      3. 注射後、カテーテルを2分間そのままにしてから、1 mm / minで引っ込めて脳内の適切な体液分散を確保し、カテーテル抜去中に注射管を密閉します
         手記：すべてのパラメータは、特定の定位ロボットに応じて1つのスクリプトにプログラムできます。
   6. CED手順を開始し、5 μLのトリパンブルー溶液をアガロースブロックに注入します。
   7. アガロース内のトリパンブルーの雲の形状と、カテーテル管に沿った潜在的な漏れを評価します。トリパンブルーは、カテーテルの先端を中心とし、直径が少なくとも1mmの楕円体または丸い雲を形成する必要があります。金属針の先端に大きな逆流があってはなりません。
   8. 新しいアガロースブロックを留置し、0.2 μL/分で1 μLの2回目の注入を開始して、カテーテルのアガロースによる目詰まりを評価します。トリパンブルーは、注射開始直後にカテーテルの先端から再び雲を形成し始めるはずです。
   9. シリンジの残量が3 μLに対応するかどうかを評価します。バリエーションがある場合は、カテーテルマウントまたはシリンジプランジャーからの液体の漏れを示している可能性があります。
   10. すべてのテスト注入が成功した場合、カテーテルはしっかりと密封され、まっすぐであり、カテーテルの先端以外の場所からトリパンブルー溶液が観察されない場合は、トリパンブルーの痕跡が見えなくなるまで脱イオンH₂O(dH₂O)でカテーテルを洗浄し、次のように10回洗浄します:70%エタノールと100%エタノール、続いて70%エタノールときれいな脱イオン水で再度洗い流します。
   11. カテーテルは乾燥した状態で保管してください。

>2. マウス脳への抗体溶液の対流増強送達

>注:地域の動物福祉規制によっては、この手順にさまざまな種類の麻酔薬、鎮痛薬、抗生物質を実装できます。このプロトコルは、注射麻酔の使用について説明しています。イソフルランなどの吸入麻酔薬は、定位フレームにノーズマスクを装着することでも使用できます。また、感染症予防のために、飲料水に抗生物質を添加することをお勧めします。

1. 手術のセットアップ
   1. 麻酔薬と解毒剤の溶液を準備します。マウスは、フェンタニル(0.05 mg / kg)、ミダゾラム(5 mg / kg)、およびメデトミジン(0.5 mg / kg)を含む3成分麻酔を滅菌蒸留水(dH₂O)で希釈して安全に麻酔することができます。フルマゼニル (0.5 mg/kg) とブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を滅菌した dH₂O (第 1 の解毒剤溶液) を含む 2 つの解毒剤溶液を使用して、2 段階のウェイクアップ手順を実行します。2番目のものは、滅菌dH₂O(2番目の解毒剤溶液)にアチパメゾール(2.5 mg / kg)を含んでいます。
   2. 滅菌dH₂Oで希釈したカルプロフェン(5.667 mg / kg)を含む鎮痛溶液を準備します。
   3. 定位ロボットの定位フレーム、加熱パッド、および要素を清掃します。すべてのロボット部品を損傷のリスクなしに清掃できるわけではないことに注意してください。清掃や使用準備の詳細については、ロボットのマニュアルを参照してください。
   4. ステップカテーテルでシリンジを組み立て、dH₂O、70%エタノール、および100%エタノールで複数回洗い流した後、70%エタノールおよびdH₂Oで再度洗い流します。最後に、シリンジをPBSまたは他の緩衝液で洗い流し、頭蓋内注射用の溶液を準備します。.、人工脳脊髄液。.シリンジプランジャーは、処置中にスムーズかつ自由に動く必要があります。
   5. 定位ロボットソフトウェアを定位フレームでキャリブレーションします。
   6. 定位ロボットソフトウェアをテストして、ロボットアームが自由に動くこと、注入ポンプが適切に接続されていること、CED手順を妨害なく実行できることを確認します。これには、ロボットの動きのテスト、ランピング注射、2分間の待機ステップの確認、カテーテルの引き込み速度の確認が含まれます。すべてのパラメータは、ポイント1.3.5で説明されている事前にプログラムされたCED手順に適合する必要があります。
   7. ドリルビットをドリルに挿入します。使用前にドリルビットを滅菌することをお勧めします。
   8. PBSまたは人工脳脊髄液(aCSF)などの他の緩衝液を使用して抗体溶液を調製します。5 μL中の抗体1〜20 μgを1回のCED手順で注入できます。その他の量とタンパク質の量は、実験を行う前にテストする必要があります。高粘度の溶液を使用すると、カテーテルが詰まる可能性があるので注意してください。
   9. 希釈した抗体をシリンジに手動でロードします。
2. 線条体へのCEDによる抗体注入
   1. マウスの体重を量り、体重に応じて3液性麻酔液を腹膜に注入します。注入時間に注意してください。マウスを加熱パッドで加熱された別のケージに移します。
   2. マウスを観察して、鎮静がいつ開始されるかを判断します。マウスの動きが止まったら、手術中に角膜が乾燥するのを防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。完全な鎮静は通常、三液麻酔液の注射後10〜15分で開始されます。
   3. ピンチ反射テストを使用して痛みの反応をチェックし、動物の完全な麻酔を確認します。
   4. ヘアトリマーを使用して頭を剃ります。
   5. ヨウ素溶液に浸した綿棒で皮膚を消毒します。円を描くように皮膚を3回こすります。
   6. 頭蓋の正中線に沿って10mmの皮膚切開を行い、メスを使用して目の高さで仕上げます。
   7. マウスをノーズクランプとイヤーバーを使用して定位フレームに固定します。頭蓋骨の表面が水平でしっかりと固定されていることを確認してください。正しい解剖学的ナビゲーションに加えて、穴あけやCED手順中に頭蓋骨を傾けないようにすることも重要です。
   8. シリンジを定位ロボットに入れます。
   9. ドリルビットを基準点のカテーテルの先端と同期させます。ドリルとシリンジの位置の関係は、脳の目的の解剖学的領域で注射を実行できるように、ソフトウェアで正確に決定する必要があります。
   10. 鉗子を使用して皮膚を引っ込め、頭蓋骨の表面にブレグマの位置を特定します。
   11. ドリルビットチップを使用して、ソフトウェアでBregmaを参照します。
   12. ドリルをブレグマから正面1mm、横2mmの位置に移動し、バリ穴を開けます。硬膜を傷つけないように注意してください。
   13. シリンジをバリ穴の上に移動します。
   14. シリンジから0.5〜1μLを分注し、カテーテルに気泡が残らないようにします。
   15. ポイント 1.3.5 で説明されている CED プログラムを起動します。頭蓋骨の表面を観察し、注入スポットからの液体の逆流の痕跡がないか確認します。動物の呼吸数を監視します。
   16. CEDプログラムが終了し、カテーテルが脳から引き抜かれたら、0.2μL / minで注入ポンプを開始して、CED中にカテーテルの詰まりを確認します。目詰まりが発生しなかった場合は、カテーテルの先端から注射液の液滴がすぐに見えるはずです。
   17. カテーテルを再利用または保管する前に、顕微鏡でカテーテルのステップを目視で検査し、損傷や摩耗の兆候がないか確認し、手順1.3.10のように清掃します。

図1:接着剤の塗布領域を示す概略図。溶融シリカチューブの上部10mmを金属針に挿入します。金属針の先端から10mmのチューブに接着剤を塗布します。