ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

要約

出典:De Marco, D. et al., Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia.J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。

プロトコル

1. BV-2 ミクログリア細胞培養

>注:バイオセーフティレベル2の封じ込め下にあるBV-2細胞を取り扱います。BV-2細胞株は、エンベロープ組換えエコトロピックレトロウイルス(マウス細胞のみに感染可能)を産生します。このようなウイルスは、in vitroでの形質転換能力とin vivoでの腫瘍形成能で知られています。

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミン(以下、培養培地と呼ぶ)を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でBV-2細胞を培養し、細胞を4 x 10⁴細胞/mLで播種します。
2. 培養物は、37°C.
   の5%_CO2の加湿雰囲気で維持します。 注:細胞は緩く付着し、懸濁液状態で成長します。

2. pH感受性蛍光色素による組換えタウ凝集体の標識

>注:タウ凝集体は、Apetri et al.に記載されているように調製しました。ただし、反応バッファーにチオフラビンT(ThT)が添加されなかったという違いがあります。凝集したサンプルを 1.5 mL の遠心チューブに収集しました。最終的な蛍光シグナルは、118 μL のプールサンプルと 12 μL の 50 μM ThT 溶液を混合して確認しました。凝集体を、凝集反応混合物を20,000 x gで4°Cで1時間遠心分離することにより分離しました。上清をSEC-MALSで分析し、すべての単量体タウが凝集体に変換されたことを確認しました。ペレット(タウ凝集体)を急速冷凍し、-80°Cの冷凍庫で保存しました。

1. 0.1 M 重炭酸ナトリウム緩衝液(NaHCO₃)に pH 8.5 のタウ凝集体を 1 mg/mL (~ 20 μM) の濃度で再懸濁します。
   手記：タウ凝集体の濃度は、0.31 ^{mLmg-1 cm-1}の吸光係数を使用して280 nmでのタウモノマーの吸収によって評価される初期モノマー濃度に基づいています。
2. 再懸濁した凝集体をプローブソニケーターを使用して超音波処理し、過熱を防ぐために氷上に保ちます。
   1. 65%の振幅を使用します(電力250 Wのソニケーターを使用)。
   2. 過熱を避けるために、パルス間に15秒の一時停止を挟んで、3秒の8パルスを実行します。
3. 製造元の指示に従って、pH感受性色素(以下、pH色素と呼ぶ)の8.9 mMストック溶液をジメチルスルホキシド(DMSO)で調製します
   手記：常に新鮮な溶液を準備し、準備した日にのみ使用してください。
4. タンパク質1モルあたり10モルの色素を、最終色素濃度0.2 mMまで添加します。
5. ピペッティングで優しく上下させて混ぜます。
6. 反応混合物を室温で45〜60分間インキュベートし、光から保護します。
7. それまでの間、メーカーの指示に従って架橋デキストランゲル脱塩カラムを組み立ててください。
8. 3% DMSOを含む25 mLの0.1 M NaHCO₃バッファーpH 8.5でカラムを平衡化します。フロースルーを破棄します。
9. タウ凝集体標識反応の生成物を、合計容量2.5 mLのカラムに加えます。サンプルが2.5 mL未満の場合は、総容量が2.5 mLになるまでバッファーを添加します。
10. サンプルをパックされたゲルに完全に入れ、フロースルーを廃棄します。
11. 3% DMSO を含む pH 8.5 の 0.1 M NaHCO₃ バッファー 3.5 mL で溶出し、溶出液を 2 mL チューブに 4 等価分で回収します。
12. ビシンコニン酸(BCA)アッセイにより、4つの画分のタンパク質濃度を測定します。
13. 標識したタンパク質を-20°Cの冷凍庫で保存します。

3. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)リードアウトによる取り込みアッセイ

1. 1日目 – 細胞の種をまく
   1. BV-2細胞をフラスコで洗浄するには、培養培地を取り出し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を添加します。
      手記：洗浄量は、使用するセルフラスコのサイズによって異なります。例えば、T175フラスコの場合は、1x PBS10 mLで洗浄します。
   2. PBSをフラスコから取り出し、トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)0.05%、37°C、5%_CO2とインキュベートして細胞をフラスコから分離するまで(約5分間)、細胞を分離します
      手記：トリプシン-EDTAの容量0.05%は、使用する細胞フラスコのサイズによって異なります。例えば、T175フラスコの場合、2mLのトリプシン-EDTA 0.05%を使用します。
   3. 培養培地で細胞を3〜5回ピペッティングして再懸濁します
      注:培養培地の量は、使用する細胞フラスコのサイズ、したがってフラスコ内の細胞の総数によって異なります。例えば、T175フラスコの場合、8mLの培養培地を使用します。
   4. 細胞をカウントし、最終濃度が1 x 10⁵細胞/mLの細胞懸濁液を200 μg/mLヘパリンを含む培地に作製します。
   5. ウェルあたり250 μLの細胞懸濁液(2.5 x 10⁴細胞)を96ウェル組織培養平底プレートにプレートします。
   6. プレートを37°Cおよび5%CO₂で一晩インキュベートします。
2. 1日目 – 免疫複合体の調製
   1. pH Dye-tauを氷上で解凍します。
   2. 無血清培地 (SFM) (100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、200 μg/mL ヘパリンを添加した高グルコース DMEM) 中の pH 色素-タウ凝集体 500 nM 溶液を 1 条件あたり 65 μL 調製します。
   3. 65 μLのSFMで抗体希釈液を調製し、最終液の2倍の濃度で調製します。pH色素タウ凝集体と抗体を96ウェルU底プレートで混合します。条件ごとの最終容量は130 μlで、pH Dye-tau凝集体濃度は250 nMです。希釈プレートをシールし、37°Cで一晩インキュベートします。
3. 2日目 – 免疫複合体の取り込み
   1. BV-2細胞から培養培地を取り出します。細胞を100 μLの室温1x PBSで1回洗浄します。
   2. 125 μLの免疫複合体をマルチチャンネルピペットを使用して細胞に移します。細胞を免疫複合体と共生し、37°Cおよび5%CO₂で2時間インキュベー
   トします。
   3. インキュベーション培地を細胞から取り出し、廃棄します。細胞を100 μLの室温1x PBSで1回洗浄します。
   4. 1x PBSを取除き、細胞を50 μLのトリプシン-EDTA 0.25%で20分間、37°Cおよび5%CO 2で処理します_。
   5. 200 μLの培養培地を加え、ピペッティングで上下させて細胞を剥離してよく再懸濁します。細胞を96ウェルU底プレートに移します。プレートを400 x gで5分間、4°Cで遠心
   分離します。
   6. プレートを氷の上に置き、培養培地を取り出し、細胞ペレットを氷冷した1x PBS150μLに再懸濁して細胞を2回洗浄します。プレートを400 x gで5分間、4°Cで遠心
   分離します。
   7. 細胞を氷上に置いて、添加した1x PBSを除去し、150 μLの冷FACSバッファー(1x PBS、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、2 mM EDTA)で細胞ペレットを再懸濁して洗浄します。プレートを400 x gで5分間、4°Cで遠心
   分離します。
   8. 細胞を氷上に置いて、添加したFACSバッファーを除去し、細胞を200μLの冷たいFACSバッファーに再懸濁します。
   9. FACSが生細胞ゲートで2 x 10⁴イベントを取得することにより、サンプルをすぐに分析します(ステップ4.1を参照)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BV-2細胞	ICLC Interlab 細胞株コレクション	ATL03001
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1X)	ギブコ	10010-015
トリプシン-EDTA 0.05%	ギブコ	〒25300-054
DMEM 4.5 g/dl グルコース	ギブコ	41966から029
ウシ胎児血清	ギブコ	10091-148
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15140122
L-グルタミン 200mM	ロンザ	17-605E
イーズYFlask	ヌンク	156499 / 159910
pHrodo グリーンSTPエステル	ライフテクノロジー	P35369
重炭酸ナトリウム pH 8.5 100 mM
DMSOの	シグマ	D2650-100ミリリットル
PD10 カラム	GEヘルスケア	〒17-0851-01
BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23225
Greiner CELLSTAR マルチウェル培養プレート	グライナー	665180
Falcon 96ウェルアッセイプレート	隼	353910
ヘパリン	シグマ	H3393-50KUさん
トリプシン-EDTA 0.25%	シグマ	T4049-100ミリリットル
BSAの	シグマ	A7030-100G
EDTA値 0.5M、pH8