ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

この記事について

要約

このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。

プロトコル

1. BV-2 ミクログリア細胞培養

>注:バイオセーフティレベル2の封じ込め下にあるBV-2細胞を取り扱います。BV-2細胞株は、エンベロープ組換えエコトロピックレトロウイルス(マウス細胞のみに感染可能)を産生します。このようなウイルスは、in vitroでの形質転換能力とin vivoでの腫瘍形成能で知られています。

10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミン(以下、培養培地と呼ぶ)を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でBV-2細胞を培養し、細胞を4 x 10⁴細胞/mLで播種します。
培養物は、37°C.
の5%_CO2の加湿雰囲気で維持します。注:細胞は緩く付着し、懸濁液状態で成長します。

2. pH感受性蛍光色素による組換えタウ凝集体の標識

>注:タウ凝集体は、Apetri et al.に記載されているように調製しました。ただ....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号
BV-2細胞	ICLC Interlab 細胞株コレクション	ATL03001
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1X)	ギブコ	10010-015
トリプシン-EDTA 0.05%	ギブコ	〒25300-054
DMEM 4.5 g/dl グルコース	ギブコ	41966から029
ウシ胎児血清	ギブコ	10091-148
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15140122
L-グルタミン 200mM	ロンザ	17-605E
イーズYFlask	ヌンク	156499 / 159910
pHrodo グリーンSTPエステル	ライフテクノロジー	P35369
重炭酸ナトリウム pH 8.5 100 mM
DMSOの	シグマ	D2650-100ミリリットル
PD10 カラム	GEヘルスケア	〒17-0851-01
BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23225
Greiner CELLSTAR マルチウェル培養プレート	グライナー	665180
Falcon 96ウェルアッセイプレート	隼	353910
ヘパリン	シグマ	H3393-50KUさん
トリプシン-EDTA 0.25%	シグマ	T4049-100ミリリットル
BSAの	シグマ	A7030-100G
EDTA値 0.5M、pH8

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