チャイニーズハムスター卵巣細胞が産生するモノクローナル抗体を精製する技術

要約

出典:Velugula-Yellela, S. R., et al.自動マイクロバイオリアクターシステムを使用したチャイニーズハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、チャイニーズハムスター卵巣細胞から採取した細胞培養液からモノクローナル抗体を精製するアッセイを示しています。これは、サンプル中の抗体のFc領域に結合する固定化されたプロテインAを含む多孔質ガラス樹脂を使用しており、それらを汚染物質から効果的に分離します。低pH溶出バッファーを使用すると、相互作用が弱まり、精製された抗体の回収が容易になります。

プロトコル

1. 抗体の精製

>注:社内抗体の平衡化バッファーは、25 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.5です。使用した溶出バッファーは0.1 M酢酸です。バッファーと樹脂(プロテインA)は、精製された特異的抗体に依存しています。カラム容量は、樹脂のベッド高さに相当します。使用する移動相の量は、カラム容量で決まります。

1. 精製システムの初期化
   1. 精製システムに付属のソフトウェアを開きます。マニュアルの指示に従って、カラムを平衡化バッファーと平衡化バッファーで 2 mL/分の流速で 40 分間平衡化します。平衡化後、手動実行を停止します。
   2. フラクションコレクターに、精製された抗体溶出液を回収するために15 mLのコニカルチューブを、高塩洗浄時のフロースルーを回収するために50 mLのコニカルチューブを配置します。フラクションコレクターが開始位置にリセットされていることを確認するには、実行を開始する前にフラクションコレクターを開閉します。フラクションコレクターは7°C.
      に維持されます。 手記：フラクションコレクターは、15 mL チューブと 50 mL チューブの両方について、設定のフラクションコレクタータブで手動でリセットできます。
2. サンプル注入
   手記： 以下の手順で用いる採取細胞培養液は、全自動マイクロバイオリアクターで培養したチャイニーズハムスター卵巣細胞から得られたものです。
   1. 0.22 μmのろ過済みハーベスト細胞培養液を、ノズル端がキャップされている空の12 mLシリンジに加えます。
   2. ノズルを下に向けてシリンジを持ち、プランジャーの小さな部分が入るまでシリンジプランジャーを挿入します。液体が漏れていないことを確認し、ノズルを上にしてシリンジを回し、キャップを取り外します。
   3. ノズルを上に向けてシリンジを保持したまま、細胞培養液がノズルの先端に来るまでシリンダーを押して空気を排出します。シリンジノズルを精製システムの手動注入ポートに挿入し、ひねって締めます。
   4. すべてのサンプルが注入され、付属の10 mLの大容量サンプルループに見えるようになるまで、プランジャーを押し下げます。
   5. 保存したメソッドファイルを開きます。結果ファイルを必要な場所に保存し、プロンプトが表示されたらファイル名を指定します。サンプルが大ボリュームのサンプルループに注入された後にヒットラン。
3. 精製メソッドの実行
   1. 保存したメソッドを選択し、装置ソフトウェアのプロンプトが表示されたら[実行]をクリックします(ステップ1.2.5).
      手記：システムは、次の手順を実行するように設定されています。機器の実行中は、ユーザーは何もする必要はありません。
   2. 3カラム容量(CV)の平衡バッファーでカラムを平衡化し、流速2 mL/分で平衡化します。カラムが平衡化されると、システムは大容量サンプルループを使用して、1 mL/分の流速でサンプルをカラムに注入します。
   3. 280 nmでのUV信号の低下は、サンプルのロードが終了したことを示します。UVシグナルが25 mAUを下回るまで、2 mL/minの流速でカラムを平衡化バッファーで洗浄します。
   4. pH 7.5 で 1 M NaCl を含む 25 mM Tris の CV を 4 個使用し、2 mL/分の流速で 2 次高塩洗浄を行います。システムフラクションコレクターは、塩洗浄中にカラムから外れたタンパク質/DNAを50 mLチューブに収集します。
   5. 5CVの溶出バッファーを1 mL/minの流速で適用し、抗体をカラムから溶出します。溶出液を UV シグナルに基づいて 15 mL チューブに集めます。UV 280信号が35 mAUを超えると、収集が開始されます。信号が50mAUを下回ると収集が終了します。これをピークカットといいます.
      手記：ピークカットにより、溶出プロファイルの正規化が保証され、タンパク質凝集体を含む可能性のある溶出ピークテーリングが回避されます。
   6. 3 CVs of Equilimation Bufferを使用してカラムを洗浄します。ランは洗浄ステップ後に終了します。
   7. 溶出後すぐに精製したタンパク質を1 M Tris塩基を用いて~5.5のpHに中和します。280 nmおよび260 nmの微量UV-Vis分光光度計を使用してタンパク質濃度を測定し、4°Cで保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CHO DG44細胞株	インビトゲン	A1100001
アクタ アバント 25	ゼネラル・エレクトリック・ライフサイエンス	28930842
Pro Sep vA ウルトラクロマトグラフィー樹脂	ミリポアシグマ	115115830	精製固定相
Omnifit 10cmコラム	Diba Fluid Intelligence(ディーバ・フルイド・インテリジェンス)	006EZ-06-10-AA	固定相用ハウジング
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP154-1
スーパーループ10 mL	GEヘルスケア	18-1113-81
μDawn マルチアングル光散乱検出器	ワイアット	ウードーン-01
0.22 μm Millex GV フィルターユニット PVDF メンブレン	メルクミリポア	SLGV033RB
10X リン酸緩衝生理食塩水	コーニング	46から013センチメートル
12 mLシリンジ	コヴィディエン	8881512878
50 mL ファルコンチューブ	コーニング株式会社	352070
96ウェルプレート	バイオ・ラッド	127737
酢酸	シグマ・アルドリッチ	695072
Amicon Ultra-4 100 kDa遠心フィルター	メルクミリポア	UFC810096
アミノ酸標準試料、1 nmol/μL	アジレント・テクノロジーズ	〒5061-3330
アミノ酸サプリメント	アジレント・テクノロジーズ	〒5062-2478
ギ酸アンモニウム溶液 - 糖鎖分析	ウォーターズコーポレーション	186007081
セプタム付きブルースクリューキャップ	アジレント・テクノロジーズ	〒5182-0717
クロマトグラフィー水(MSグレード)	フィッシャーケミカル	W6-4
塩酸	フィッシャーサイエンティフィック	A144-500
インタクト mAb 質量チェック標準品	ウォーターズコーポレーション	186006552
Intrada アミノ酸カラム 150 x 2 mm	イムタクト	WAA25
NanoDrop One 微量紫外可視分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	840274100

の さん