サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>パート1:解離した胎児のげっ歯類の海馬ニューロン培養の確立
>1. 準備手順
- めっき表面のポリ-L-リジン(PLL)コーティング(解剖の3日前)
- 2.38 gのホウ酸と1.27 gのホウ砂を500 mLの蒸留水に加え、溶解するまで15分間撹拌して、ホウ酸緩衝液を調製します。フードの下で、緩衝液をろ過して滅菌し(孔径0.2 μm)、標識し、室温(RT)で保存します
手記： この溶液は安定しており、6か月間使用できます.
注意: ホウ酸塩バッファーを調製するときは、推奨される個人用保護具を着用してください。
- 蒸留水10 mLにPLL1 gを加え、溶解するまで撹拌して、PLL原液(100 mg/mL)を調製します。PLL原液500μLアリコートを調製します。最終濃度を 1 mg/mL にするには、500 mL の PLL アリコートを 50 mL のホウ酸バッファーに加え、溶解するまで渦巻き、ろ過 (0.2 μm の孔径) で溶液を滅菌します
手記： この溶液は安定しており、6ヶ月間使用できます。
- コーティング用の表面を準備します。免疫染色には直径12mmのカバースリップを、生きたニューロンのイメージングを含む研究にはガラス底皿を使用します。カバースリップを使用する場合は、オートクレーブ処理してから、各ディッシュ(直径3.5cm)に5枚のカバースリップを置きます
手記：カバースリップの厚さは、取得される画像の信号の品質と強度に影響します。ほとんどの顕微鏡対物レンズは、#1.5カバースリップ用に設計されています。イメージングのセットアップと技術に応じて、適切なカバースリップを選択してください。
- フードの下に、各ディッシュ(ガラス底ディッシュまたはカバースリップ5枚付きの3.5cmディッシュ)に1.5mLのPLL溶液を追加します。すべてのカバースリップが水没し、RTで24時間保管されていることを確認してください。
- 解剖の2日前に、PLL溶液を吸引し、滅菌済みのエンドトキシンフリー水で洗浄し、カバーガラスが水没していることを確認します。皿に水を入れ、RTで24時間保管してください。
- 解剖の1日前に、水を吸引し、NB + B27培地(下記参照)と交換し、皿を37°Cのインキュベーターに24時間置きます。
- 培地と原液の調製(解剖の1日前)
- ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM):L-グルタミンとフェノールレッドを含まない500 mLのDMEM高グルコース(4.5 g / L)に、50 mLのウマ血清、50 mLのウシ胎児血清(FBS)、10 mLのL-グルタミン(200 mM)、10 mLのピルビン酸ナトリウム(100 mM)、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を追加します。.(孔径0.2μm)をろ過し、キャップを密閉して4°Cで5mLアリコートに保存します
手記：このソリューションは安定しており、1か月間使用できます。
- B27(NB + B27)を添加した神経基礎(NB)培地:フェノールレッドを含まない50 mLのNB培地に、1 mLのB27サプリメントを追加します。
- B27を添加したHibernate-E培地(Hibernate + B27):50 mLのHibernate-E培地に、1 mLのB27サプリメントを加えます。
- 細胞外生理液(EPS):滅菌水1 Lに、指定された最終濃度でNaCl(140 mM)、KCl(3.5 mM)、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES、10 mM)、グルコース(20 mM)、およびCaCl2(2 mM)を所定の最終濃度で添加します。溶解するまで撹拌し、NaOH(0.5 M)またはHCl(0.5 M)を加えてpHを7.4に調整します。ボンネットの下では、ろ過(0.2μmの孔径)で滅菌し、4°Cで保存します。
- 機器およびその他の実験材料(解剖日)
- ウォーターバスを37°Cにセットし、50 mLのHanks' Balanced Salt Solution(HBSS)と5 mLのDMEMを加熱します。
- 無水エタノールを含むビーカーに浸して、次のツールを滅菌します（図1B）:鉗子、湾曲した鉗子、はさみ、細い湾曲した鉗子、細い直線鉗子、手術用はさみ、細かい角度の鉗子、および精密ばねはさみ
手記：ツールを保護するために、ビーカーの底に柔らかい素材(科学精密ワイプなど)を置きます。
- 2つのトレイに氷を入れ、次のアイテムを置きます。
- アイストレイ1(図1C):無水エタノールを入れたビーカーに手術器具を入れ、手術器具をすすぐためのHBSS入りビーカー、胚を配置するためのHBSS入り10cm皿、胚の頭部を置くためのHBSS入り6cm皿、胚の脳を置くためのHibernate+B27入り6cm皿を入れます。
- アイストレイ2:トリプシン1%のアリコート2.5と、解剖した海馬用のHibernate+B27を入れた3.5cmの皿を置きます
手記：この手順に必要な時間は、研究者の経験と解剖する胚の数によって異なります。したがって、氷は必要な時間凍結したままにする必要があります。この目的にはポリスチレントレイをお勧めします。
2. 解剖と播種(図1)
- 海馬分離
手記： 胚18日目(E18)に胚を持つ妊娠ラットは、実験動物の使用と世話に関するヨーロッパ(2010/63/UE)の規制に従って、バルセロナ大学の地元の倫理委員会に従って、プロトコルが始まる直前に安楽死させます。この議定書では、安楽死の方法として二酸化炭素(CO2)吸入が使用されました。
- 鉗子とハサミを使用して、腹部腹膜のレベルでラットを解剖します。E18胚で子宮を摘出し、氷の上で冷やした10cmの皿に入れます
注:ラットの毛が胚に付着しないようにすることが重要です。腹部を滅菌するために、70%エタノールを大量に使用することをお勧めします。このステップから先、製氷皿1のフードの内側で作業します。
- 胚嚢を開き、HBSSを使用して胚を10cm皿に移し、胚が完全に浸されていることを確認します。
- 胚の頭部をハサミで取り外し、HBSSを入れた6cmの皿に入れます。このプロセスをすべての胚で繰り返します.
手記：汚染を避けるために、胚の頭を除くすべての組織は、スクリューキャップ付きの容器に廃棄する必要があります。
- 胚の頭部を細かい湾曲した鉗子で保持し、一対の細い直線の鉗子で軌道を突き刺し、45°の角度で入り、次に細い湾曲した鉗子を解放します
手記： 鉗子は脳を通ってはいけないので、入るときは角度を保つことが大切です。
- 手術用ハサミで、後頭骨から前頭骨まで皮膚と頭蓋骨を解剖します。一対の細かい湾曲した鉗子で脳を取り出し、Hibernate+B27で6cmの皿に入れます。すべての脳が回復するまで、このプロセスを繰り返します。
- 細いまっすぐな鉗子で終脳を矢状的に分離します.
手記： このステップ以降、海馬の解剖は実体顕微鏡下で行われます。光が解剖面を側面から照らすように、多関節式ランプを使用することをお勧めします。また、黒の背景を使用するとコントラストが増し、海馬をより区別できるようになるため、黒の背景を使用することをお勧めします。
- Hibernate + B27を1 cmの距離(円など)に滴を置いて、10cmの皿を準備します。Hibernate + B27の1滴につき1つの終脳を配置し、解剖スコープ(1.25倍の対物レンズ倍率を推奨)で視覚化します。
- 髄膜を慎重に剥がし、視床を取り除き、海馬をよりよく視覚化します。
- 精密スプリングハサミで海馬を解剖し、アイストレイ2にHibernate+B27を入れた3.5cm皿に入れます。すべての海馬が収集されるまで、すべての終脳について繰り返します。
- パスツールピペットですべての海馬を慎重に収集し、50mLチューブに移します.
手記： 海馬を採取するときは、トリプシンを希釈しないように、最小量のHibernate+B27を服用してください。
- 細胞の解離
- 海馬の酵素的解離
- 海馬が入った50mLのチューブに、2.5%トリプシンを1mL加え、HBSSで5mLの容量にします。37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。
- トリプシンを希釈するには、予熱したHBSSを10 mL加え、37°Cの水浴中で5分間インキュベー
トします。
- 粘液塊として現れた海馬を1,000 μLマイクロピペットで50 mLチューブに移し、予熱したHBSSを6 mL加え、37°Cのウォーターバスで5分間インキュベートします。
- 海馬の機械的解離
- 塊を円錐形の底部を有する2mLチューブに移し、最小容量で移します。予熱したDMEM培地1mLを添加します。1,000 μLのマイクロピペットでペレットを上下に穏やかに吸引して均質化します。
手記：気泡が細胞を溶解する可能性があるため、吸引時には気泡の発生を避けることが重要です。
- 事前に引っ張ったガラスピペット(10x-20x)で、その先端をチューブの円錐形の底に接触させて、上下の吸引を繰り返します。気泡の発生を避けてください。このステップの最後に、混合物は半透明でなければなりません。
- 混合物が半透明になるように均一に混合したら、混合物を4 mLのDMEM培地を含むチューブに37°Cで移し、ガラスピペットでピペッティングしてホモジナイズします。
- 細胞播種
- セルを数えます。溶液中のニューロンの数は、標準的な実験室の手順に従って数えることができます.
手記： 抗体検出とカルシウム活性のためのイメージング実験では、3.5cmディッシュあたり50,000細胞の濃度が最適です。
- 細胞を懸濁させたまま、計算量を引き出し、PLLコーティングされたカバースリップを含む3.5cmのディッシュまたはPLLコーティングされたガラス底ディッシュにプレートします。
- 交差した動き(前後、次に左右、必要に応じて繰り返す)で柔らかく振ることにより、細胞を皿に均等に分布させ、皿をCO2(5%)インキュベーターに入れます><。
手記：細胞が皿の周辺に沈殿するのを避けるために、交差した動きを使用することが重要です。
- 毎週、約1mLのNB + B27を追加して、培養物が乾燥しないようにします.
手記： 2週間後(in vitro [div]で14日)、ニューロンは成熟し、実験に使用するすべての因子を発現します。このプロトコルを使用して得られるニューロンの総数は、妊娠ラットあたり平均12個のE18胚から来る約2.5×106ニューロンである。
>パート2:ニューロン細胞表面タンパク質の抗体検出のための海馬ニューロン培養の使用
>注:プロトコルのこの部分は、抗NMDAR脳炎患者の血清および/またはCSF中の抗NMDAR抗体を同定するために海馬培養がどのように使用されるかを示しています。蛍光免疫染色は、生ニューロンの反応性を可視化するために使用されますが、他の可視化方法も使用できます。この実験の適切な制御は、健康な個人の血清またはCSFです。ヒトサンプルを使用する場合は、機関の倫理委員会からの承認が必要な場合があることに留意してください。
3. ライブ蛍光免疫染色
- カバースリップ上に増殖させたdiv細胞を14個使用します(カバースリップを5枚含む3.5cmディッシュあたり50,000細胞)。
- フードの内側で、37°Cに予熱したNBでカバースリップをすすぎます。
- この場合、抗NMDAR抗体(一次抗体として使用)を含むサンプルをNB培地で1:200(血清用)または1:2(CSF)に希釈したサンプルを添加し、37°Cで1時間インキュベートします(CO2(5%)インキュベーター内)。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でRTで3回注意深くすすいでください。
- 固定液(PBS中の4%ホルムアルデヒド)を添加し、室温で5分間インキュベートします
注意：4%ホルムアルデヒドを取り扱う場合は、フードの内側で作業し、推奨される個人用保護具を着用してください。
- PBSで3回、各5分間洗浄します。
- 二次抗体ヤギ抗ヒトAF488を1:1000希釈で添加し、室温で1時間
インキュベートしてください。
手記：インキュベーション中は、アルミホイルで覆って光から保護してください。
- PBSで3回、各5分間洗浄します。蒸留水ですすいでください
- カバーガラスを液体封入剤(例:DAPIによる退色防止封入剤、約7 μL)で封入し、残った液体を吸引して蒸留水ですすいでください。これで、ニューロンは蛍光イメージングの準備が整いました。
注意：封入剤を取り扱う際は、推奨の個人用保護具を着用してください。
