サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>注:特に明記されていない限り、すべてのステップはBSL2フードで実行する必要があります。プラーク減少中和(PRN)アッセイの前にウイルス滴定を行い、PRNアッセイで使用される最適なRSV濃度を決定する必要があります。ウイルスストックを少量分注し、1回解凍して各NAbアッセイに使用することをお勧めします。また、1つの研究のすべてのサンプルに対して実施するすべてのNAbアッセイに同じウイルスストックを使用することも推奨されます。培地とリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞プレートに添加する前に、37°Cで温めてください。
1. RSVウイルス滴定
>注:ウイルスストックの数と重複の数に応じて、アッセイプレートは図1に従ってセットアップできます。各ウイルスストックは、アッセイプレートを下回って、ウイルス濃度が最も高いもの(1:10)から3回ずつ滴定する必要があります。連続滴定は通常1:10です。A549細胞の培養と維持、およびRSVの培養手順は、標準的な手順を使用して行われ、このプロトコルには含まれていません。
- 播種プレート(1日目)
- A549細胞をダルベッコのModified Eagles培地(DMEM)+ 10%ウシ胎児血清(FCS)+ 1000 IUペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/連鎖球菌)に4 x 105/mLで再懸濁します。4 x 10 4 個の A459 細胞を含む 100 μL/ウェルの 96 ウェル平底滅菌プレートをシードします。
- プレートを37°C、5%の二酸化炭素(CO2)で一晩インキュベートします(細胞は対数期増殖します)。
手記： 23回の継代後に新しいA549セルバイアルを使用してください。新しい細胞バイアルがまだ最初の3つの継代にあるときには、実験を開始しないことをお勧めします。
- ウイルス感染(2日目)
- ウイルスの段階希釈の調製
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の凍結バイアル1本を37°Cの水浴でほぼ完全に解凍するまで急速に解凍し、すぐに氷の上に置きます。アッセイするRSVウイルスストックごとに3回の繰り返しを調製し、100 μLの希釈ウイルス/ウェルで1:10の初期ウイルスストック希釈を使用し、ネガティブコントロール用に少なくとも1つのカラムを予約します。
注:図1は、ネガティブコントロールをトリプリケートで示しています。
- 希釈した各ウイルスを1:10で100 μLを、96ウェルU底滅菌プレートのA列の三重に添加します。90 μL/ウェルのDMEM + FCSなしの1000 IUペン/連鎖球菌を行BからHに加えます。
- 列Aから列Bに10μLを移して、プレートで1:10の希釈を行います。ピペッティングで内容物を5回上下させて溶液を混合し、列Hまで10倍希釈を続けます。各ウェルの最終容量が90μLになるように、最後の10μLを廃棄します
注:希釈ごとに新しいチップを使用することが重要です。
- A549細胞へのウイルス接種
- 前日に調製したA549細胞プレートを取り出します。96ウェルプレートのA549細胞単層が~80%コンフルエントであることを確認してください。プレートを静かに反転させ、滅菌済みの吸収性ペーパータオルで軽く吸い取って、メディアを廃棄します。
- すべてのウェルを100 μLのPBSで2回洗浄し、プレートを静かに反転させ、洗浄するたびに滅菌吸収性ペーパータオルで軽く吸い取って、余分なPBSを廃棄します。プレートを乾かさないでください。
- ウイルス滴定プレート(図1)からA549細胞プレート上の対応するウェルにウイルス希釈液を移します。プレートを37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、ピペットを使用して上清をデカントします(交差汚染を避けるため)。90 μL/wellを取り出します。
- 1x 培地 199 (M199、材料表参照) + 低粘度 1.5% カルボキシメチルセルロースナトリウム塩 (CMC) + ペン/連鎖球菌を含む2% FCS を各ウェルに 100 μL 加えます
注:2x M199 + 4%FCS + 2%ペン/連鎖球菌および3% CMC溶液は、将来使用するために4°Cで調製および保存する必要があります。プレートに加える前に、溶液が37°Cで温められていることを確認してください。
- 2x M199溶液を準備します:1袋/ 500 mL蒸留水+ 20 mL FCS + 10 mLペン/連鎖球菌(2x MI99を構成するため)。0.22 μmのフィルターユニットを使用して溶液をろ過します。
- 3% CMC を調製するには、15 g の CMC を 500 mL の蒸留水にゆっくりと加えます。CMCを金属攪拌機ヒーターを使用して50°Cで水に溶解します(準備に約1時間かかります)。よく混ぜて3%CMCを作り、溶液をオートクレーブします.
注:CMC固体を溶解するには、水に追加する必要があります。乾燥した固体に水を加えると、溶解が非常に難しい固体の「塊」が生成されます。
- ステップ1.2.2.4.2で調製した2x M199と3%CMCを1:1で混合することにより、1x M199 + 1.5% CMC低粘度+ 2% FCS含有ペン/連鎖球菌を調製します。
- プレートを37°C、5%CO2で3日間インキュベートします。
- アッセイプレートの開発と分析(5日目)
- アッセイプレートの固定と現像
- プレートを静かに反転させて、ペン/連鎖球菌を含むM199 + CMC + 2%FCSを廃棄します。(細胞層を乱さないように)200 μLの固定バッファー(80%アセトン、20%PBS、-20°Cで保存)をゆっくりと加えて細胞を固定します。-20°Cで20分間インキュベートします。
- 固定バッファーを捨て、吸収性のペーパータオルでやさしく拭き取ります。プレートを下向きにして10分間乾かします。
手記： このステップ以降、アッセイはBSL2フードの外側で行うことができます。
- 0.05%ポリソルベート20(PBS-ポリソルベート、材料の表を参照)を含むろ過済みPBSに5%ミルク希釈剤ブロッキング溶液を調製します。200 /ウェルと 110 ウェルに基づいて、1 つのプレートのブロッキングに必要な容量を計算します: 200 μL/ウェル x 110 ウェル = 22 mL (ろ過された PBS-ポリソルベート 20.9 mL に 1.1 mL の濃縮ミルク希釈剤)。この段階では、一次抗体と二次抗体のための十分なブロッキング溶液も作ります。50 μL/ウェルと110ウェルに基づいて、1プレートの各抗体溶液に必要な容量を計算します:50 μL/ウェル x 110ウェル = 5.5 mL。したがって、シングルプレートアッセイに必要な乳希釈剤ブロッキング溶液の総量は33 mLです。
- ブロッキング溶液を200 μL/ウェル加えます。プレートを室温(RT)で30分間インキュベートします。プレートを静かに反転させて溶液を捨て、吸収性のペーパータオルで吸い取ります。
- ブロッキング溶液で希釈した1:500ヤギ×RSV抗体(mAb-一次抗体)を調製します。mAb溶液50 μL/ウェルを加え、37°Cで1時間インキュベートします。プレートをろ過したPBS-ポリソルベートで3回洗浄します。
- ブロッキング溶液で希釈した1:5,000 Alexa-Fluorロバ抗ヤギIgG(二次抗体)を調製します。二次抗体溶液50 μL/wellを添加し、37°Cで1時間インキュベートします。プレートをろ過したPBS-ポリソルベートで5回洗浄します。
- 図2に示すように、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)チャンネルとカウント設定を使用して、自動スポットリーダーでプレートを読み取ります。プレートをホイルで包み、4°Cで保存します。未使用の96ウェル培養プレートを使用し、アッセイ前にカウント設定を入力して装置を校正します。
手記： 必要に応じて、数日以内に再スキャンすることも可能です。キャリブレーションとカウントの設定は保存して、アッセイがキャリブレーションに使用したのと同じタイプのプレートを使用している場合、将来のスキャンに使用できます。
- ウェルの画像でアーティファクトプラークや破壊された細胞単層を確認します(図3)。細胞単層が破壊されたウェルを除外します.
手記： アーティファクトプラークのサイズによっては、それらのウェルに対して手動でカウントを実行する必要がある場合や、それらのウェルをデータ分析から破棄する必要がある場合があります。有効な結果の基準には、複数の複製ウェルで破壊された細胞単層またはアーティファクトプラークが検出されないこと、および陰性ウェル(ウイルスが添加されていないウェル)でプラーク形成単位(PFU)が検出されないことが含まれます。
- ウイルス濃度の測定
- スポットが明確にカウントできる最後の2つの希釈液を選択します。同じ希釈率の複製ウェルからの平均スポット数を計算します。ストックサンプルのウイルス力価(PFU/mL)は、以下の式で計算します:
PFU/mL = 平均プラーク数/(希釈係数 × ウェルに添加された希釈ウイルスの量)
手記：各RSVストックについて決定されたウイルス濃度は、PRNアッセイで使用できるようになりました(ステップ2)。
>2. RSV中和アッセイ
- 播種プレート(1日目)
- A549細胞をDMEM + 10% FCS + 1000 IUペン/連鎖球菌に4 x 105/mLで再懸濁します。4 x 104 A459 細胞を含む 100 μL/ウェルで 96 ウェル平底滅菌プレートを播種し、プレートを 37 °C、5% CO2 で一晩インキュベートします (細胞は対数期増殖になります).
手記：23回の継代後に新しいA549セルバイアルを使用してください。継代番号3より前にA549細胞を使用することはお勧めしません。
- ウイルスと血清の調製(2日目)
手記：サンプルの種類によっては、NAbアッセイの前にサンプルを前処理するために必要な手順があります。これは、国立生物標準管理研究所(NIBSC)からの要求に応じて現在利用可能であるRSV国際標準血清を使用することをお勧めします。
- 血清希釈液の調製
- ヒトRSV参照抗血清(参照血清、REF)および血清試験サンプルをRTで解凍し、血清サンプルおよび参照抗血清を56°Cの水浴で30分間加熱不活性化してから使用してください。プレートテンプレートに従って希釈液を調製します(図4)。
- アッセイプレートごとに、DMEM + ペン/連鎖球菌で希釈した REF を 1:100 mL 以上調製します (例: 総容量 150 μL の REF 1.5 μL)。1:100希釈したREFを110 μL、96ウェルU底滅菌プレートのウェルA12に加えます。
- 55 μL の DMEM + FCS なしのペン/溶連菌をウェル B12 から H12 のカラム 12 に加えます。列 A から列 B に 55 μL を移し、溶液をピペッティングで 5 回上下し、列 H まで続けて、プレートで 1:2 の連続希釈を行います。各ウェルの最終容量が 55 μL になるように、最後の 55 μL の培地を廃棄します。希釈ごとに新しいチップを使用します。
- 血清試験サンプルを1:100に希釈して調製します。すべての血清サンプルはトリプリケートでアッセイされるため、血清試験サンプルあたり最小容量110 μL/ウェル x 3 = 330 μLを調製します。
- 希釈した血清試験サンプル1個につき110 μL(1:100;S1 = 血清 1、S2 = 血清 2 など)図4に記載の96ウェル滅菌プレートの対応するウェルA1〜A9、およびE1〜E9
。
- X とラベル付けされたすべてのウェルに 55 μL の DMEM + FCS なしのペン/連鎖球菌を添加し、ステップ 2.2.1.3 に従って 1:2 の連続希釈を行 D まで行います (サンプル 1、2、3)。各ウェルの最終容量が55 μLになるように、最後の55 μLの培地を廃棄します。同様に、サンプル4、5、および6の行EからH.
に対して、連続1:2希釈を実行します
手記：希釈ごとに新しいチップを使用することが不可欠です。
- 55 μL の DMEM + FCS なしのペン/連鎖球菌をカラム 10 および 11 のウェルに加えます。
- ウイルスの調製
- RSVの凍結バイアル1本を37°Cのウォーターバスでほぼ完全に解凍するまで急速に解凍し、すぐに氷の上に置きます。
- ステップ 1.3.2 で決定した RSV アリコートの濃度に基づいて、DMEM + ペン/連鎖球菌でウイルスを希釈します。約200 PFU/ウェルが得られる希釈液を塗布します。総容量5.5mL(100ウェル用)を調製します。
- ウイルス - 血清混合物の調製
- プレートテンプレートに従って、希釈したウイルス55 μLをカラム1〜9のすべてのウェルとカラム10および11の行E〜Hのウェル(ポジティブコントロール)に加えます(図4)。
- 55 μL DMEM + FCSなしのペン/溶連菌を、列10および11の行A-Dのすべてのウェルに加えます(ネガティブコントロール)。プレートを37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。
- A549細胞へのウイルス接種
- インキュベーション期間が完了する前に、ステップ2.1.1で調製したA549細胞プレートを回収します。96ウェルプレートのA549細胞単層が~80%コンフルエントであることを確認してください。
- プレートを静かに反転させ、滅菌済みの吸収性ペーパータオルで軽く吸い取って、メディアを廃棄します。すべてのウェルを100μLのPBSで2回洗浄し、プレートを静かに反転させ、洗浄するたびに滅菌吸収性ペーパータオルで軽く吸い取って余分なPBSを廃棄します。プレートを乾かさないでください。
- ウイルス-血清混合物の100 μL/ウェルを、プレートテンプレートに従ってA549細胞プレート上の対応するウェルに移します。プレートを37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。
- 1時間後、ピペットを使用して90 μL/ウェルを取り出し、予熱した1x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + ペン/連鎖球菌を100 μL加えます。プレートを37°C、5%CO2.
で3日間インキュベートします。
手記：プレートに加える前に、溶液が37°Cで温められていることを確認してください。
- アッセイプレートの開発と分析(5日目)
- 1.3.1.1から1.3.1.8までの手順に従って、固定プレートとアッセイプレートを開発します。
- 50%の中和力価を決定します
- 「無血清」コントロールウェルの50%以上と50%未満の相互血清希釈間の比例距離を計算することにより、50%の中和力価を決定します(陽性ウイルスコントロール-10列目、行E-H)。
- 血清コントロールウェルおよび血清コントロールウェルなしの個々のウイルス感染から生じるPFU(すなわち、プラーク)の数を数えます。無血清コントロールウェルのPFUの平均数を計算し、50%の値を決定します。
血清- 希釈液を同定し、そのカウントが無血清コントロールウェルの 50% 値のすぐ上および下にあります。セミロググラフまたはスプレッドシートテンプレートを使用して、PFUの数をX軸(線形スケール)に、Y軸(Log10スケール)に相互血清希釈をプロットします。2点の間に線を引き、この線から試験血清サンプルの50%中和力価を読み取ります。
