電気化学発光アッセイを用いたヒト膵島自己抗体の検出

要約

出典:Gu, Y. et al., Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies.J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオでは、ヒト血清中の膵島自己抗体の電気化学発光検出を紹介しています。血清中の抗体は、ルテニウム結合抗原とビオチン化捕捉抗原を架橋し、電気化学発光測定によって検出される複合体を形成します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. バッファーの準備

1. 標識緩衝液(2倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.9):400 mLの蒸留脱イオン(DD)水に100 mLの10x PBSを加え、水酸化ナトリウム(NaOH)でpHを7.9に調整します。
2. 3 mMのビオチン:1 mgのビオチンを588 μLの標識緩衝液に溶解します。
3. 3 mM の Sulfo-tag :150 nm ol の Sulfo-tag を 50 μL の標識バッファーに溶解します。
4. 抗原緩衝液(5% BSA):1x PBS500 mLに、25 gのウシ血清アルブミン(BSA)を加えます。
5. 0.5 M酢酸溶液を調製します。
6. 1.0 M の Tris-HCl バッファー pH 9.0:1 M の Tris-HCl バッファーを調製し、HCl で pH を 9.0 に調整します。
7. コーティングバッファー(3%ブロッカーA):1x PBS500 mLに15 gのブロッカーAを加えます。
8. 洗浄バッファー(0.05 % Tween 20、PBST):5000 mLの1x PBSに2.5 mLのTween 20を加えます。
9. 読み取りバッファー(2x Read Buffer T with Surfactant):500 mLのDD水に、500 mLの4x Read Buffer T with Surfactant(材料表)を加えます。
10. ビオチンとスルホタグは-20°Cの冷凍庫で保存してください。
    手記：ビオチン溶液とスルホタグ溶液は、標識手続きの直前に必ず新たに調製する必要があります。

>2. ヒト島自己抗原をビオチンとスルホタグで標識

する

>注:より効率的な標識反応のためには、高濃度の抗原、≥0.5 mg/mLが推奨されます。

1. ビオチンおよびスルホタグに対するヒト膵島自己抗原のモル比を決定します。
   1. 抗原のモル数を取得するには、抗原の重量を分子量で割ります。
   2. 分子量が小さい抗原(≤10 kd)はモル比1:5、分子量が大きい抗原(>50 kd)はモル比1:20を使用します。
   3. ビオチンまたはスルホタグの体積は、モル数をその濃度で割って計算します。
2. ヒト膵島自己抗原をビオチンまたはスルホタグとモル比1:5.
   で混合します 手記：トリスバッファーまたはグリシンバッファーシステムのいずれかで、サイジングスピンカラムを使用して、pH 7.9の2x PBSバッファーに交換する必要があります。
3. ビオチンとスルホタグは感光性があるため、反応チューブをアルミホイルで覆います。反応液を室温(RT)で1時間インキュベートします。
4. インキュベーション中に、2x PBSバッファーをカラムに3回分注してスピンカラムをプライミングします。溶液を1000 x gで毎回2分間遠心分離します
   手記：現在、架橋による標識反応はまだ発生しており、停止する必要があります。
5. 標識されたヒト膵島自己抗原を精製することにより、標識反応を停止します。精製するには、自己抗原をスピンカラムに通し、カラムを1000 x gで2分間遠心分離します。
6. 抗原タンパク質の量と最終容量を使用して、標識された抗原濃度(μg/μL)を決定します。
   手記：おおよそ、スピンカラムを通過するたびに、標識抗原の90〜95%が保持されます。
7. 標識抗原を分注し、標識抗原を-80°Cで保存します。

3. アッセイ用の2つの標識抗原の最適な濃度と比率を定義します(Checker Board Assay)

1. 高陽性と陰性の 2 つの血清サンプルを調製し、それぞれに合計容量 200 μL を加えます。
2. 4 μL の血清を分注し、最終容量が 20 μL /ウェルになるまで 1x PBS を添加して、96 ウェルポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プレートにします。図1Aに示すように、プレートの半分を高陽性サンプルに使用し、残りの半分を陰性サンプルに使用します。
3. 10 μLのビオチンと10 μLのスルホタグ標識抗原を添加し、図1Aに示すように、2つの異なる標識抗原の段階希釈を行います。1つの標識抗原に対して水平段階希釈を実行し、他の標識抗原に対して垂直段階希釈を実行します。
4. 5.3から9.1に記載されている残りのアッセイステップを続けます。
5. 図1Bに示す負のサンプルからの対応する各信号に対する、高い正のサンプルからの信号の比率を計算します。
6. ビオチンおよびスルホタグ標識抗原の最適な濃度を特定するには、陽性と陰性の比率が最も高い、またはほぼ高いポイントを選択します。ネガティブサンプルからの低バックグラウンドシグナルを考慮して、比率を特定します。
   手記：アッセイ1日目には、ステップ4からステップ6が含まれます。

>4. 正しい濃度のビオチン/スルホタグ標識抗原を使用して抗原緩衝液を調製します。

1. チェッカーボードアッセイに基づいて、各抗原の合理的な濃度を選択します。
2. 抗原バッファーに合理的な濃度のビオチン/スルホタグ標識抗原を使用して、プレートあたり3 mLの抗原溶液を調製します。

>5. 標識抗原を用いた血清サンプルのインキュベート

>注:このセクションには、血清酸処理なしと血清酸処理なしの2つのプロトコルがあります。インスリン自己抗体(IAA)アッセイを除くすべての膵島自己抗体アッセイは、ステップ5.1から5.5まで血清酸処理なしの通常のプロトコルを使用しますが、IAAアッセイはこれらのステップをスキップし、ステップ5.6から5.9まで血清酸処理を伴うプロトコルを使用します。

1. 4 μL の血清を分量し、最終容量が 20 μL になるまで 1x PBS を添加して、96 ウェル PCR プレートにします。
2. 標識抗原溶液をウェルあたり20 μL加えます。
3. 光を避けるために、PCRプレートをシーリングホイルで覆います。
4. プレートをシェーカー(低速)に載せ、RTで2時間待ちます。
5. プレートを4°Cの冷蔵庫に入れ、一晩(18〜24時間)インキュベートします
   手記：以下の5.6から5.9までのステップのプロトコルは、IAAアッセイ専用に設計されており、他の自己抗体アッセイはこれらのステップを省略します。
6. 各血清サンプルについて、15 μLの血清と18 μLの0.5 M酢酸を混合します。この混合物をRTで45分間インキュベートします。
7. チェッカーボードアッセイに基づき、抗原バッファーを用いて、ビオチンおよびスルホタグ標識抗原の合理的な濃度で抗原溶液を調製します。各ウェルで、ビオチンとスルホタグ標識抗原を含む抗原バッファー35 μLを新しいPCRプレートに分注します。
8. 45分間のインキュベーション(ステップ5.6)が終了する前に、抗原プレート上の各ウェルの側面に8.3 μLの1 M Tris pH 9.0バッファーを加えます(ステップ5.6)。Trisバッファーと抗原との混合を制限することが重要です。ステップ5.6で酸で処理した血清25μLを直ちに各ウェルに移し、溶液を攪拌します。光を避けるために、PCRプレートをシーリングホイルで覆います。
9. プレートを非常温のシェーカー(低速)に2時間置き、プレートを4°Cの冷蔵庫に入れ、プレートを一晩(18〜24時間)インキュベートします。

6. ストレプトアビジンプレートを準備します

1. 4°Cの冷蔵庫からストレプトアビジンプレートを取り出し、プレートをRTに持ち込むのを待ちます。
2. ストレプトアビジンプレートがRTになったら、各ウェルに150 μLの3% Blocker Aを加えます。
3. PCRプレートをシーリングホイルで覆います。
4. プレートを4°Cの冷蔵庫で一晩インキュベートします。
   注:アッセイ2日目には、ステップ7からステップ9が含まれます。

>7. 血清/抗原インキュベートをストレプトアビジンプレートに移す

1. 翌日、冷蔵庫からストレプトアビジンプレートを取り出し、プレートからバッファーを廃棄します。乾いたペーパータオルをテーブルの上に置き、ウェル内にバッファーがなくなるまでプレートを逆さまに軽くたたきます。
2. 空のストレプトアビジンプレートにウェルあたり150 μLのPBSTを充填し、プレートからPBSTを廃棄して合計3回の洗浄を行います。
3. ウェルごとに30 μLの血清/抗原インキュベート液をストレプトアビジンプレートに移します。
4. 光を避けるためにプレートをホイルで覆います。プレートを低い設定で、RTで1時間振ってください。

>8. プレートを洗浄し、読み取りバッファを追加します

1. 廃棄はプレートからインキュベートします。ウェルあたり150 μLのPBSTを添加し、PBSTをプレートから廃棄して、合計3回の洗浄を行います。
2. 洗浄後、Reading buffer.
   のウェルあたり150 μLを添加します。 手記：溶液中の気泡を防ぐことは、プレートリーダーマシンでのプレートの読み取り方法に影響を与えるため、重要です。

結果

図1:アッセイ陽性率のカットオフを決定するためのROC曲線。85% の感度に対応する特異度の 99^パーセンタイルを選択し、0.023 の指数値で表されます。このアッセイの上限は、100人の健康なコントロールから取得されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト組換えプロインスリンタンパク質(PINS)	アミドバイオ	ヒトプロインスリン、Rec
ヒト組換えGAD65タンパク質	ディアミド	RHGAD65
ヒト組換えIA-2タンパク質	クリエイティブバイオマート	IA2
1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023
10x PBS、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒70011-044
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アロリッチ	A7906-500Gの
96ウェルPCRプレート	漁夫	14230232
ストレプトアビジンコーティングプレート	MSDの	L15SA
Zebaサイジングスピンカラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	89890
トゥエン-20	漁夫	BP337-500
HCl	漁夫	A144-500
NaOH	漁夫	SS255-1
トリズマベース	漁夫	BP152-5
EZ-Linkビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PI21329
スルホタグ	MSDの	R91AO-1
ブロッカーA	MSDの	R93AA-1
4x リードバッファ T (界面活性剤付き)	MSDの	R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-ビオチン	サーモサイエンス	21329
スルホTAG	MSDの	R91AO-1
96ウェルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレート	フィッシャーブランド	14230232
96ウェルストレプトアビジンプレート	MSDゴールド	L 15SA-1
Zebaスピン脱塩カラム	サーモサイエンス	PL208984
96ウェルプレートシェーカー	パーキン・エルマー	〒1296-003
プレートリーダー	MSDの	クイックプレックスSQ120
バケットロータリー付き卓上遠心分離機	ベックマン	アレグラ X-15R

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