免疫グロブリンGを検出するための紙ベースのイムノアッセイ

要約

出典:Peng, Y. et al., セルロースペーパーディスクへの抗体の共有結合と裸眼比色免疫測定法におけるそれらの応用。J. Vis. Exp. (2016年度)

このビデオは、グルタルアルデヒドと架橋されたアミン官能化セルロースディスクを含む紙ベースのイムノアッセイを示しています。IgG-Fc特異的捕捉抗体の共有結合固定化に続いて免疫グロブリンGおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識検出抗体を導入すると、免疫グロブリンGの存在を確認する色の変化が生じます。

プロトコル

1. セルロース紙ディスクへのアミン官能基のグラフト

化

1. 寸法が1cm×1cmの角紙1枚と、直径6.0mmのグレード1セルロース紙(中流濾紙)から作られた紙ディスク100枚を穴あけパンチで用意します。
2. 紙ディスク上の-NH₂基を導出するには、ドラフト内の50mlガラス瓶に1 mlの3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APS)と10 mlのアセトンを混合します。調製したばかりのAPS試薬混合物に紙ディスクを加え、室温で軌道撹拌(200 rpm)で5時間インキュベートします。
   注意：フュームフード内のAPSとアセトンを取り扱います。
3. 50 mlのガラス瓶から余分な溶液を有機廃棄物容器にデカントします。.
4. ガラス瓶にアセトン10mlを加え、よく混ぜて完全にデカントし、未反応のAPSやその他の不純物を取り除きます。この手順を 2 回繰り返します。
5. ペーパーディスクをペーパータオルの上に広げ、110°Cのオーブンに3時間置き、ペーパーディスクを冷まします。ディスクを50 mLの遠心分離チューブに室温で保存します。
6. フーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して、以下で説明するように、セルロース正方形の紙上のアミン基のグラフトを確認します(図1A)。
   1. コンピュータの電源を入れ、FTIR分光装置を開きます。
   2. FTIR分光法のソフトウェアを開きます。
   3. 「Measurement → Initialize」に進みます。初期化が完了すると、「BS:KBr」、「Lamp:Infrared」、「Laser」の長方形が緑色に変わります。
   4. 四角形の下の「データ」を選択し、「測定モード」、「アポダイゼーション」、「スキャン数」、「解像度」、「範囲(cm-1)」で「%透過率」、「Happ-Genzel」、「45」、「4.0」、「最小:400、最大:4000」を選択します。
   5. 「測定」をクリックします。
   6. バックグラウンドデータとして「データファイル」を選択します。コメントを書き留めます。
   7. [BKG] をクリックして、背景のベースラインを取得します。
   8. フィルムサンプルホルダーに正方形の紙を固定します。
   9. サンプルデータとして「データファイル」を選択します。コメントを書き留めます。
   10. 「Sample」をクリックして、サンプルのスペクトルを取得します。
   11. FTIR分光法アプリケーションを閉じ、コンピューターの電源を切ります。
7. 上記の手順(ステップ1.1〜1.6)を繰り返して、アミン官能化グレードNo.113セルロース角紙とディスク(高速流濾紙)を調製し、グレードNo.113角紙(図1B)のFTIRスペクトルを取得します。

2. 免疫グロブリンG(IgG)検出のための紙ベースの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)

1. 5 mLの0.05%グルタルアルデヒド溶液(50 mM PBS緩衝液、pH 7.4で調製)を20 mLのガラス瓶に加えます。15個のアミン官能基中流濾紙ディスクをこの溶液に浸し、室温で振とうしながら1時間保持します。
   1. 同時に、ステップ2.1を繰り返して、別の15アルデヒド官能化高速フロー濾紙ディスクを準備します.
      注意：ヒュームフード内のグルタルアルデヒドを処理します。
2. 紙ディスクから未反応のグルタルアルデヒドを除去するには、15枚の中流型ろ紙ディスクを15 mLの遠心分離管に入れ、15枚の高速流ろ紙ディスクを別の15 mL遠心分離管に入れます。各チューブに5mlのDI水を加え、チューブを10秒間振とうします。ピペットで吸引して水を取り除きます。2回繰り返して、未反応のグルタルアルデヒドを取り除きます。
3. 紙のディスクを37°Cのオーブンで乾かします。
4. 0.025 mg/mlのマウスIgG-Fcフラグメント抗体5 μlおよび8 μlを中流および高速流の濾紙ディスクにそれぞれ加え、20分間インキュベートします。
5. 抗体を取り除かずに、各紙ディスクに50 mM PBS(pH 7.4)10 μlを加え、アミンアルデヒド反応のために40分間インキュベー
トします。
6. ペーパータオルの上に0.2mlの洗浄バッファーでペーパーディスクを洗います。洗濯を3回繰り返します。
7. 紙のディスクを37°Cのオーブンで乾燥させます。
8. 紙のディスクを15 μlのブロッキングバッファーで室温で10分間ブロッキングします。
9. ペーパータオルの上に0.2mlの洗浄バッファーで各ペーパーディスクを洗います。洗濯を3回繰り返します。
10. IgG標準を実行します。
    1. さまざまな濃度のIgG(PBSで0、10、125、250、500 ng/mlなど)10 μlを各ディスクに3回ロードします。室温で1時間インキュベートします。
11. ペーパータオルの上に0.2mlの洗浄バッファーでペーパーディスクを洗います。洗濯を3回繰り返します。
12. HRP標識マウスIgG-Fcフラグメント抗体(1:10,000、10 mM PBS、pH 7.4)10 μlをロードし、室温で1時間インキュベー
トします。
13. ペーパータオルの上に0.2mlの洗浄バッファーでペーパーディスクを洗います。洗濯を3回繰り返します。
    手記：洗浄バッファーの存在によって結果が影響を受けないため、洗浄バッファーを取り外す必要はありません。
14. TMBと過酸化水素の混合物10 μlを各ディスクにロードします。
15. 5分間のインキュベーション後に、デジタルカメラまたはスマートフォンですべての紙ディスクの画像を撮影します.
    手記：図2Aにおいて、「0」は捕捉抗体固定化で処理された紙ディスクと、IgG血清を含まない抗体-HRP/TMB溶液を表しています。
16. 画像Jにより、画像内の各紙ディスクの強度を解析します。
    1. 手順3.15で撮影した画像を「.tif」形式に変換します。
    2. 「Image J」ソフトウェアを開きます。
    3. [ファイルを開く→]に移動し、分析する画像を選択します。
    4. 形状ボタン「楕円形」を選択します。
    5. 「Image → Type → 32 bit」に移動します。
    6. 「編集→反転」に移動します。
    7. 「Analyze → Measure」に移動します。
    8. スプレッドシートのデータをコピーして分析します。

結果

図 1.未処理およびAPS処理の中流濾紙(A)および高速流濾過角紙(B)のフーリエ変換赤外(FTIR)スペクトル。未処理の中流濾過角紙のスペクトルは、APS処理中流濾過角紙のスペクトルと同程度であった。APS処理された正方形の紙の902-1,170 ^cm-1および1,210-1,500 ^cm-1のバンドでの強度の増加は、それぞれSiOC-H基のSi-O-セルロースおよびC-H変形に属していました。1,650 ^cm-1および2,885 ^cm-1におけるバンドの増分は、それぞれ生理食塩水プロピル部分からの-NH₂およびCH₂振動の曲げに属する。972 cm-1 から 1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルロース濾紙、Grade1(中流濾紙)	GE Healthcare Pte Ltd シンガポール	1001 110
セルロース濾紙、Grade113(高速流濾紙)	Sigma-Aldrich, シンガポール	1113-320
3-アミノプロピルトリメトキシシラン	Sigma-Aldrich, シンガポール	T1255	>96%
グルタルアルデヒド	Sigma-Aldrich, シンガポール	G6257	グレードII、H2Oで25%
ウシ血清アルバム	Sigma-Aldrich, シンガポール	A2153の
脱脂粉乳	ルイ・フランソワ		Packed by キッチンケイパーズ、シンガポール
トリスベース	プロメガ	H5135-J
過ヨウ素酸ナトリウム	メルク	106597
Na2HPO4	メルク	106585
KH2PO4	メルク	104873
NaCl	カルバイオケム	567441
NaOH	メルク	106462
HCLの	メルク	100317
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	該当なし	該当なし	137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.0 mmol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4を含むPBSは、水で調製し、0.1 mol/L NaOHまたは0.1 mol/L HClでpH 7.4に調整
アセトン	Tee Hai Chem Pte Ltd シンガポール	9005-68
TMBと過酸化水素溶液の混合物	1ステップウルトラTMB-ELISA溶液、Thermo Scientific Pierce	34029	1リットル
アフィニティー精製ヤギ抗マウスIgG-Fcコーティング抗体	ベチルラボラトリーズ株式会社	A90-131A型
マウスリファレンスセラム	ベチルラボラトリーズ株式会社	RS10-101-5	9.5 mg/mL
HRP標識ヤギ抗マウスIgG-Fc検出抗体	ベチルラボラトリーズ株式会社	A90-131Pシリーズ
備品
フーリエ変換赤外分光光度計	島津製作所IRプレステージ-21	該当なし
オーブン	ヌーブ FN500	該当なし
ターボミキサー VM-2000	MYC株式会社	該当なし
画像J	RGB、無料ダウンロード	該当なし

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