Candida tropicalis Biofilmに対する抗体の影響を評価するためのIn vitroアッセイ

要約

出典: Chandley, P., et al. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオは、真菌バイオフィルムに対する抗体の影響を研究するためのin vitro技術を示しています。病原性真菌であるカンジダ・トロピカリスは、アスパチルプロテイナーゼ2(Sap2)を分泌する病原性因子を分泌し、バイオフィルムの形成を促進します。バイオフィルムの成熟を阻害するSap2特異的抗体を含む熱不活化血清を導入すると、真菌細胞の生存率は発色アッセイを使用して評価されます。

プロトコル

1. C. tropicalis バイオフィルム形成

1. 前述のように、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートでカンジダバイオフィルムを調製します(図1)。
2. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLのC. tropicalis培養物(上記のように調製した10個の⁶細胞/mLストック)を96ウェルマイクロタイタープレートに加えます(図2A)。最後の 2 つの列 (11 と 12) は、真菌細胞を追加しないために、「真菌と血清なし」および「真菌と血清なし」の陰性コントロールとして維持します。カラム 11 および 12 に 100 μL の Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640 モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)培地のみを満たします。
3. マイクロタイタープレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを定常条件下で37°Cで24時間インキュベートします。
4. 翌日、マルチチャンネルピペットを使用して培地を慎重に吸引します(バイオフィルムに触れたり、乱したりしないように)。ブロッティングシート上でプレートを逆さまに軽くたたいて、残留媒体を取り除きます。
5. マルチチャンネルピペットを使用して、200 μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(ウェルあたり)でプレートを洗浄します。バイオフィルムを乱さないように、井戸の側壁に沿ってPBSを非常に穏やかに加えます。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを慎重に吸引します。PBSウォッシュを2回繰り返します(合計3回のウォッシュ)。
6. 余分なPBSを除去するには、プレート(蓋なし)を生物学的安全キャビネット内で室温で30分間風乾します。

2. 抗体によるバイオフィルムの処理

>注:抗体によるバイオフィルムの成熟の阻害を評価するために、バイオフィルムを処理できるようになりました。マウス血清は、ポリクローナル抗体の供給源として使用されました。Sap2免疫されたさまざまなグループ(Sap2-albicans、Sap2-tropicalis、およびSap2-parapsilosis)と偽免疫マウスを眼窩後から出血させ、血清を単離しました。抗Sap2抗体の存在は、Sap2特異的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて確認されました。

1. 使用前に血清(ポリクローナル抗体の供給源)を56°Cで30分間熱不活性化し、阻害活性における補体の役割を除外します。血清を希釈する前に血清を熱不活化します.
   手記：偽免疫マウス、免疫前マウス、およびSap2特異的抗体枯渇血清の血清を追加コントロールとして使用します。抗体が枯渇した血清は、以前の研究に従って調製されました。このプロトコルで試験した血清の段階希釈液(1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1,600、1:3,200、1:6,400、および1:12,800)のうち、バイオフィルムの成熟の阻害は1:25、1:50、および1:100で観察されました。したがって、抑制と血清消費のバランスをとるために1:50が選択されました。
2. 滅菌RPMI 1640 MOPS培地(1:50)で、加熱不活化血清サンプルの段階希釈液を調製します。バイオフィルムの成熟の阻害について試験するすべての血清サンプルに共通の血清希釈(1:50)を使用します。
3. 選択した血清希釈液100 μLを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えます。各サンプルについて、添付のレイアウトに従って、血清希釈液を重複して追加します(図2B)。
   1. カラム 10 には、血清希釈液を追加せず、真菌のみのポジティブコントロールには RPMI 1640 MOPS 培地のみを追加してください。
      手記：列10、行G1-G8およびH1-H8は、最初にRPMI-MOPSに真菌細胞を持っていました。しかし、24時間後でもRPMI-MOPSが列10に追加されたのに対し、行G1-G8はPBSコントロールとして機能し、行H1-H8は24時間後に無血清コントロールとして機能しました。
   2. カラム 11 で、1:50 希釈した血清をすべてのウェルに加え、真菌と血清の陰性コントロールを併用しないでください。
   3. 12列目では、血清希釈液をウェルに加えず、これを無真菌無血清陰性コントロールとして保持してください。
4. プレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを37°Cで24時間インキュベー
トします。

>3. バイオフィルム代謝活性推定

1. 翌日、マルチチャンネルピペットを使用して(バイオフィルムに触れたり、乱したりせずに)血清を慎重に吸引します。プレートをブロッティングシートの逆さの位置で軽くたたいて、残留した血清を取り除きます。.
2. マルチチャンネルピペットを使用して200 μLの1x PBS(ウェルあたり)でプレートを洗浄し、バイオフィルムの破壊を避けるためにウェルの側壁に沿ってPBSを追加します。マルチチャンネルピペットを使用してPBSを慎重に吸引し、PBS洗浄を2回(合計3回の洗浄)繰り返します。プレート(蓋なし)を生物学的安全キャビネット内で室温で30分間風乾し、余分なPBSを乾燥させます。
3. XTT(2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド)/メナジオンの調製:
   1. 滅菌リンゲル乳酸でXTTを0.5 g / L溶液として調製します。.25 mgのXTTをフィルター滅菌した50 mLのリンガーズ乳酸に溶解します。.10 mLをアルミホイルで覆われた別々のチューブに分注し、-80°Cで保存します。
   2. メナジオンを10 mMストックとして調製します。8.6 mgのメナジオンを5 mLのアセトンに溶解し、50 μLを100本の別々のマイクロチューブに分配します。アリコートは-80°Cで保存します。
   3. 使用直前にXTT/メナジオン溶液を調製し、10 mLのXTTを摂取し、1 μLのメナジオンを加えて1 μMの作業溶液を得ます。
4. 96ウェルマイクロタイタープレートのウェルあたり100μLのXTT/menadione溶液を添加します。プレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを暗所で37°Cで2時間インキュベー
トします。
5. 各ウェルから80 μLの着色上清を新鮮な96ウェルプレートに移します。プレートを490nmで読み取ります。
6. カラム 10 のウェルの吸光度値の平均を計算します (真菌のみのポジティブコントロール)、これは式 (1) を使用して各血清サンプルによるバイオフィルム阻害率を計算するための参照値として機能します。
   % バイオフィルム阻害 = 100 - × 100 (1)

結果

図1:Candida tropicalisバイオフィルムのイメージング。(A)倒立顕微鏡を用いた、RPMI培地除去後の96ウェルマイクロタイタープレートの底面に形成されたCandida tropicalisバイオフィルムの可視化。画像は明視野顕微鏡を使用してキャプチャされました(染色は使用されていません)。(B)クリスタルバイオレット染色後の96ウェルマイクロタイタープレートの底面に形成されたC.tropicalisバイオフィルムの視覚化。(C)走査型電子顕微鏡を用いたスライドガラス上に形成されたC. tropicalisのバイオフィルムの可視化。スケールバー = 100 μm (A,B)、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mLコニカル遠心チューブ	BDファルコン	546021
1x PBSの	-	ラボで調製	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:0.72 g KH2PO4 : 0.12 g 水500mL。pHを7.4に調整
50 mLコニカル遠心チューブ	BDファルコン	546041
96ウェルマイクロタイタープレート	ヌンク	442404
孵卵器	ジェネリック
メナディオーネ	シグマ	M5625
マイクロタイタープレートリーダー	ジェネリック
マルチチャンネルピペットとヒント	ジェネリック
ペトリ皿	ターソン	460090
リンガー乳酸	-	ラボで調製	塩化ナトリウム0.6g、乳酸ナトリウム0.312g、塩化カリウム0.035g、塩化カルシウム0.027g、水100mL。pH 7.0に調整
RPMI 1640 モップス	ハイメディア	AT180
XTTの	インビトゲン	X6493

します する