Candida tropicalis Biofilmに対する抗体の影響を評価するためのIn vitroアッセイ

要約

出典: Chandley, P., et al. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオは、真菌バイオフィルムに対する抗体の影響を研究するためのin vitro技術を示しています。病原性真菌であるカンジダ・トロピカリスは、アスパチルプロテイナーゼ2(Sap2)を分泌する病原性因子を分泌し、バイオフィルムの形成を促進します。バイオフィルムの成熟を阻害するSap2特異的抗体を含む熱不活化血清を導入すると、真菌細胞の生存率は発色アッセイを使用して評価されます。

プロトコル

1. C. tropicalis バイオフィルム形成

1. 前述のように、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートでカンジダバイオフィルムを調製します(図1)。
2. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLのC. tropicalis培養物(上記のように調製した10個の⁶細胞/mLストック)を96ウェルマイクロタイタープレートに加えます(図2A)。最後の 2 つの列 (11 と 12) は、真菌細胞を追加しないために、「真菌と血清なし」および「真菌と血清なし」の陰性コントロールとして維持します。カラム 11 および 12 に 100 μL の Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640 モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)培地のみを満たします。
3. マイクロタイタープレートを蓋とアルミホイルで覆います。プレートを定常条件下で37°Cで24時間インキュベートします。
4. 翌日、マルチチャンネルピペットを使用して培地を慎重に吸引します(バイオフィルムに触れたり、乱したりしないように)。ブロッティングシート上でプレートを逆さまに軽くたたいて、残留媒体を取り除きます。
5. マルチチャンネル....

結果

図1:Candida tropicalisバイオフィルムのイメージング。(A)倒立顕微鏡を用いた、RPMI培地除去後の96ウェルマイクロタイタープレートの底面に形成されたCandida tropicalisバイオフィルムの可視化。画像は明視野顕微鏡を使用してキャプチャされました(染色は使用されていません)。(B)クリスタルバイオレット染色後の96ウェルマイクロタイタープレートの底面に形成されたC.tropicalisバイオフィルムの視覚化。(C)走査型電子顕微鏡を用いたスライドガラス上に形成されたC. tropicalisのバイオフィルムの可視化。スケールバー = 100 μm (A,B)、.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mLコニカル遠心チューブ	BDファルコン	546021
1x PBSの	-	ラボで調製	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:0.72 g KH2PO4 : 0.12 g 水500mL。pHを7.4に調整
50 mLコニカル遠心チューブ	BDファルコン	546041
96ウェルマイクロタイタープレート	ヌンク	442404
孵卵器	ジェネリック
メナディオーネ	シグマ	M5625
マイクロタイタープレートリーダー	ジェネリック
マルチチャンネルピペットとヒント	ジェネリック
ペトリ皿	ターソン	460090
リンガー乳酸	-	ラボで調製	塩化ナトリウム0.6g、乳酸ナトリウム0.312g、塩化カリウム0.035g、塩化カルシウム0.027g、水100mL。pH 7.0に調整
RPMI 1640 モップス	ハイメディア	AT180
XTTの	インビトゲン	X6493

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