空腸凍結切片における房状細胞の可視化のための免疫蛍光法

Abstract

出典:Mizutani, Y. et al., 自由浮遊マウス空腸切片における腸房細胞の可視化のための抗リン酸化ギルジン抗体の使用。J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオは、自由浮遊マウス空腸切片の腸房細胞を可視化するための免疫蛍光法を示しています。腸絨毛内では、管腔先端に緑色の蛍光が広がり、赤い細根の塊が広がっていることは、房状細胞の存在を示しています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 事前準備

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)10 Lを調製する:リン酸水素ナトリウム32.27 g(Na₂HPO₄・12H₂O)、リン酸二水素ナトリウム4.5 g(NaH₂PO₄・2H₂O)、塩化ナトリウム(NaCl)80.0 gを超純水に最終容量10 Lまで添加する溶液を室温(RT)で保存する。
2. 200 mLのPBS-Tを調製します:ステップ1.1から200 mLのPBSを100 μLのポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルとともに、最終濃度0.05%(vol:vol)まで調製します。RTで保管してください。
3. 手袋と目の保護具を着用しながら、10%緩衝中性ホルマリン溶液に50mLの15%スクロースを準備します:7.5 gのスクロースを10%緩衝中性ホルマリン溶液(材料表)に添加して、最終容量50 mLにします。.RT.
   で保存 注意：10%緩衝中性ホルマリン溶液中のホルムアルデヒドを吸入および/または皮膚/眼に接触させると、危険な場合があります。取り扱いには注意してください。
4. 1.5 mLの200ユニット/ mLファロイジン蛍光色素コンジュゲートストック溶液を調製します:ファロイジン蛍光色素コンジュゲート(1バイアルに300ユニット、凍結乾燥固体、励起波長、発光波長:それぞれ581 nmおよび609 nm)をメタノール1.5 mLに懸濁します。溶液は-20°Cの暗所で保存してください。
5. 5 mg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)原液:10 mg、2 mLのN、N-ジメチルホルムアミド(DMF)にDAPIを調製します。溶液は-20°Cの暗所で保存してください。
6. PBS中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製します:0.5 gのBSA、10 mLのPBS。.4°Cで保存してください。
7. 18ゲージのストレートニードルの斜めの先端をニッパーで取り外し、ニッパーでニップの端を縦方向につまんで、液体が針の内腔を流れるようにします(図1A1).
   手記：ここでプロトコルを一時停止できます。

2. 動物の解剖と空腸の分離

1. マウスの灌流固定
   1. 手袋を着用し、換気の良い場所で作業してください。
   2. 100mLのガラスビーカー、10%緩衝中性ホルマリン溶液、手術器具(はさみ、鉗子)、金属トレイ、6-0ナイロンカット縫合糸、1.7のように調製した18ゲージの直線針、22ゲージの翼付き針、20mL注射器を準備します。
   3. ガラスビーカーから20 mLの10%緩衝中性ホルマリン溶液を20 mLシリンジにロードし、22ゲージのウィングニードルを出口に取り付けます。
   4. 50 mLの遠心分離チューブで20 mLのPBS(最終5%ゼラチン)に1 gのゼラチン粉末を加えて、液体ゼラチンを調製します。室温で15分間浸漬した後、50°Cの水浴で15分間振とうせずにインキュベー
   トしてください。
   5. 短時間ボルテックスし、50°Cでさらに15分間インキュベートして、ゼラチンを完全に溶解します。使用するまでチューブをRTのままにします。
   6. 成体マウスを頸部脱臼で安楽死させます。
   7. ステップ2.1.6のマウスを金属製のトレイに置き、手術器具を使用して腱状軟骨を通して皮膚に小さな切開を行います。
   8. 切開部を両手で広げて、胸部と腹部を露出させます。
   9. 腹膜を開いて横隔膜を露出させ、次に両側の横隔膜を開きます。
   10. 両側の腋窩前線に沿って胸郭を切開し、胸腺の位置を横方向に切開して心臓を露出させることで胸壁を切除します。
   11. 右心房の耳介に小さな切開をして血液を排出し、22ゲージの翼のある針を左心室の頂点に挿入します。プランジャーを押して、10%緩衝中性ホルマリン溶液で組織を灌流します。
   12. 骨盤内の臓器を露出させた後、直腸の端を肛門から切り取り、腸間膜を切開して腸を体から分離します。
   13. 空腸を分離するには、胃前庭の肛門側から4cmで腸を切開します。残りの小腸の肛門半分を捨てます。
   14. 空腸を半分にクリップして、フラッシング手順を容易にします。20 mL シリンジに 20 mL の 10% 緩衝中性ホルマリン溶液 20 mL をロードし、ステップ 1.7 で調製した 18 ゲージのストレートニードルを出口に取り付けます。
   15. クリップした空腸の一方の端から10%緩衝中性ホルマリン溶液を注入して、腸の内容物を洗い流し、腸内腔表面を固定します(図1A2)。
   16. ステップ2.1.15で説明されているようにPBSを注入して腸内腔を洗浄します。
   17. ステップ2.1.15で説明されているように、液体ゼラチンを腸内腔に洗い流して、PBSを液体ゼラチンに置き換えます。
   18. 6-0ナイロンカット縫合糸を使用した縫合結紮によってクリップされた空腸の一端を閉じ、空腸を液体ゼラチンで満たし、縫合結紮によって反対側の端を閉じます(図1A3)。
   19. ソーセージ型の空腸切片をクライオモールドの陥没部分にフィットさせるために、4つの縫合糸の結び目を追加します(図1A4)。
       手記：20 mm x 25 mm x 5 mmのくぼんだ部分を持つクライオモールドの場合、~20 mmのソーセージ様空腸切片が好ましいです。
   20. 組織を15%スクロース50mLに浸し、10%緩衝中性ホルマリン溶液に浸し、4°Cで一晩
       手記：これらのステップにより、スクロースによる凍結保護と、ゼラチンおよび組織のホルマリンによるタンパク質固定が保証されます。ホルマリンゼラチン化ゼラチンはRTでは溶けませんが、4°Cの非固定ゼラチンゼラチンはRTで溶けます。

3. ゼラチン充填空腸組織のスナップ凍結

1. 縫合糸の結び目で空腸を切断することにより、両端が結紮された3つのソーセージ様空腸片が得られます(図1A4)。凍結組織標本を調製するための包埋化合物を添加するために、凍結型でソーセージ様のピースを整列させます。
2. 液体窒素で冷却したイソペンタンでクライオモールドをスナップ凍結します。クライオモールドを-80°Cで保存
   注:プロトコルはここで一時停止できます。

>4. フリーフローティングクライオ切片を用いた房状細胞の免疫蛍光法

1. クライオセクショニング
   1. クライオスタットチャンバー温度(CT)と物体温度(OT)の両方を-22°Cに設定し、凍結組織ブロックをクライオスタットチャンバー内のクライオモールドに少なくとも15分間置きます。
   2. 35 mmの培養皿に3 mLのPBSを加えます。
   3. 凍結したティッシュブロックをクライオモールドから取り出し、カミソリの刃でブロックを半分に切って空腸の横断面を露出させます。ブロックの半分をチャック(クライオスタットアダプター)に取り付けて、カミソリの刃で切断面を切断します。
   4. ゼラチンを充填した空腸を厚さ30μmの切片に切片化します。凍結した鉗子を使用して、ステップ4.1.2で調製した35 mmの培養皿に切片を静かに移します(図2B、右)。
2. 一次抗体の応用
   1. 35 mm培養皿の浮遊切片を、3 mLのPBS-Tでそれぞれ5分間3回、往復振盪機で軽く振とうしながら5分間洗浄します(約36回/分)。
   2. 抗原賦活化液の調製:2.7mLの超純水に0.3mLの抗原賦活化液濃縮液(材料表)を添加します。3 mLの抗原賦活化溶液を、フリーフローティングセクションを含む35 mm培養皿に加えます。
   3. 蓋を閉め、ディッシュと蓋の間の隙間をビニールテープで密封し、ハイブリダイゼーションインキュベーターで50°Cで振とうせずに3時間インキュベートします。
   4. インキュベーターから皿を取り出し、室温で20分間冷却します。ビニールテープをはがした後、切片を3mLのPBS-Tで各5分間3回洗浄し、軽く振とうします。
   5. PBS-Tを吸引し、ブロッキング溶液(材料の表)を5滴セクションに追加します。室温で5分間、軽く振とうしながらインキュベートします。
   6. 一次抗体溶液を調製します:PBS中の5%BSA495 μLと5 μLのリン酸化Y1798ガージン(pY1798)抗体(材料表)。切片に500 μLの一次抗体溶液を添加します(ブロッキング溶液を除去する必要はありません)。
   7. ディッシュを加湿インキュベーションチャンバーに入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
      手記：一晩のインキュベーションは、最大3泊まで延長できます。
3. 二次抗体の応用
   1. 切片を3mLのPBS-Tでそれぞれ5分間3回、軽く振って洗浄します。
   2. 希釈したDAPI原液を調製します:2 μLのDAPI原液(ステップ1.5)、998 μLのPBS
   原液。
   3. 二次抗体溶液を作製:PBS溶液5%BSA476μL、希釈DAPI溶液10.5μL、ファロイジン蛍光色素コンジュゲートストック溶液12.5μL、ヤギ抗ウサギIgG蛍光色素コンジュゲート1μL(波長:励起496nm、発光520nm)。
   4. PBS-Tを吸引した後、二次抗体溶液を塗布し、光遮光インキュベーションチャンバー内でRTで30分間、軽く振とうしながらインキュベー
   トします。
   5. 切片を3mLのPBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄し、軽く振とうします。
   6. 最終洗浄後、PBS-Tを取り外し、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルを欠くPBS3mLと交換します。皿を実体顕微鏡に移します。
   7. MASコーティングされた白色スライドガラスの中央の液滴に200μLのPBSを置き、P200ピペットチップを使用して皿から1つの空腸切片を液滴に移します。
   8. 実体顕微鏡でセクションの位置合わせを調整した後、セクションの周囲に残っているすべてのPBSを吸引します。
   9. 20 μLの水性封入剤を加え、20 x 20 mmのカバーガラスを培地の上に置きます。
   10. カバースリップの端をキシレンベースの封入剤ですぐに密封してください。スライドを木製のマッペに置き、キシレンベースの封入剤を室温で2〜3時間固化させます
       手記：ここでプロトコルを一時停止できます。キシレンベースの封入剤が固まった後、スライドはRTの遮光スライドボックスに2〜3週間保存できます。

5. 共焦点顕微鏡

1. 共焦点顕微鏡の63倍対物レンズに液浸油を塗ります。カバースリップスライドを下に回し、スライドをステージに置きます。
2. レーザー波長405、488、555nmで取得したTC画像をデジタル化し、画像をtiff形式(.tiff)で保存します
   手記：蛍光色素に適した検出フィルターセットをお選びください(励起/発光の最大値:358/461 nm、490/525、590/617)。

Results

図1:凍結切片の形態学的保存のための空腸切片のゼラチン充填
(A)マウス空腸にゼラチンを管腔内充填する手順の写真 (A1)腸壁を貫通しないように、18ゲージのまっすぐな針の斜めの先端を取り外しました。 (A2)緩衝中性ホルマリン溶液(10%)をクリップした空腸の一端に注入して腸の内容物を洗い流し、腸内腔表面を固定しました。 (A4)既存の縫合糸の結び目(黒い矢印)の間にさらに4つの縫合糸の結び目(白い矢印)を配置すると、3つの短いピースが得られました。次に、組織は指定された 2 つの位置 (白い矢印)<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:DDY 6週齢の雌マウス	中部化学紙財	該当なし
リン酸水素二ナトリウム 12- 水 (Na2HPO412H2O)	和光	〒196-02835
ジヒドロエンリン酸ナトリウム二水和物(NaH2PO42H2O	和光	〒199-02825
塩化ナトリウム(NaCl)	和光	〒199-10665
トリトンX-100、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル	片山化学工業	該当なし
蔗糖	和光	〒190-00013
10%緩衝中性ホルマリン溶液	武藤化学工業	20215	ステップ1.3。
ファロイジン-蛍光色素コンジュゲート、Alexa Fluor 594 ファロイジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12381 (英語)
メタノール	ナカライ・テスク	21915-35
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306
N.N-ジメチルホルムアミド(DMF)	ナカライ・テスク	13015-75
ウシ血清アルブミン	シグマ	A9647-10Gの
18ゲージステンレス鋼ストレートニードル	テルモ	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm ナイロンカット縫合糸, クラウンジュン	河野製作所	該当なし
22ゲージ翼付き針	テルモ	SV-22DLKの
テルモシリンジ 20mL	テルモ	SS-20ES
50 mL遠心チューブ	TPPとは	91050
いわき遠心チューブ15mL	いわき	〒2325-015
1.5mLマイクロ試験管	星	RSV-MTT1.5
ゼラチンパウダー、ジェラールブラン	新田バイオラボ	2809
凍結組織検体用包埋コンパウンド O.C.T. コンパウンド 118 mL 12 個	さくらファインテック	4583
クライオモールド クライオディッシュ No.3 125個 ウェルサイズ 20×25×5 (mm)	シューイワークス	1101年3月
イソペンタン	ナカライ・テスク	26404から75
ファルコン細胞培養ディッシュ 35 x 10mm イージーグリップ	コーニング	353001
抗原賦活化液濃縮液、ターゲット賦活化液 pH9 10x	ダコ	S2367	ステップ4.2.2の抗原賦活化溶液濃縮物。
プロテインブロック	ダコ	X0909	4.2.5のブロッキングソリューション。
Phospho-Y1798 girdin (pY1798)抗体と関連製品	免疫生物学研究所(IBL)=X社	28143	ステップ4.2.6のリン酸化Y1798ガージン抗体。
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11034 (英語)
Aquous封入剤、Prolong Gold 退色防止封入剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P36930
カバースリップ、松波マイクロカバーガラス 22×22mm 100個 厚さNo.1	松波ガラス	C022221
Entellan New、キシレンベースの顕微鏡用封入剤	メルクミリポア	107961
MASコーティングスライドガラス ホワイト	松波ガラス	MI-MAS-01
木製マッペ KOタイプ	シューイワークス	〒99-40007
イマージョンオイル 518 F 蛍光フリー 20 ml	ツァイス	444960
ピペット、ピペットマンP(P2、P20、P200、P1000)	ギルソン	F144801、F123600、F123601、F123602
超純水製造装置	アドバンテック	GS-590
プラスチック手袋、スターニトリル手袋	星	RSU-NGVM
クライオスタット	ライカマイクロシステムズ	CM1950
ディープフリーザー SANYO Ultra Low	三洋電機	MDF-382
ショーケース冷蔵庫	日本冷凍庫	NC-ME50EC
ウォーターバス サーモミンダー SDminiN(ゼラチンを50°Cで溶解する)	タイテック	0068750から000
ハイブリダイゼーションインキュベーター(50°Cでの抗原賦活化用)	タイテック	HB-100
免疫染色用インキュベーションチャンバー	コスモバイオ	10DO
免疫組織化学用レシプロシェーカー(室温用)	タイテック	NR-1
免疫組織化学用レシプロシェーカー(4C用)	東京 リカ機械	MMS-3010
実体顕微鏡(ティッシュハンドリング用)	オリンポス	SZ61
実体顕微鏡(図1B用)	ライカマイクロシステムズ	M165FC
蛍光顕微鏡(図3用)	ニコン	E800
共焦点レーザー走査型顕微鏡	ツァイス	LSM700