動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 293T細胞のルシフェラーゼによるトランスフェクションとウイルス上清の採取
- 293T細胞の培養
- それぞれ1リットルのダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に以下を追加して培地を準備します:110 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、11 mLのペニシリン-ストレプトマイシン。.
- 5 x 106 293T細胞を解凍し、上記のように調製した培地でT175フラスコに移します。
- 293T細胞を3日ごとに1:10で6日間分割します。細胞が90%以上コンフルエントにならないようにしてください。
- 293T細胞のトランスフェクション
手記：293T細胞のT175フラスコ1つをトランスフェクションするために、以下の量の試薬が計算されます。より多くのフラスコを形質転換する場合は、それに応じて調整してください。
- ピペットを使用して、1.5 mLの培地を2本の50 mLチューブのそれぞれに移します。1本のチューブに、VSV-Gプラスミド10 μg、Gag/pol 20 μg、クリックビートルレッドTDトマト(CBR-TDR)ルシフェラーゼプラスミド20 μgを加えて混合します。もう一方のチューブにDNA in vitroトランスフェクション試薬100 μLを加えて混合します。両方のチューブを室温(RT)で5分間インキュベートします
手記：この原稿に記載されているすべてのプラスミドは、Vladimir Ponomarev博士によって提供されました。
- DNA in vitroトランスフェクション試薬を含む培地をDNAプラスミドの入ったチューブに滴下(約30秒以上)移し、ピペットで穏やかに混合します。室温で20分間インキュベートします。
- この20分間のインキュベーション中に、0.05%トリプシンを5〜10mL添加して293T細胞を剥離します。細胞が分離したら、10 mLの培地を加え、800 x gで5分間遠心分離します。細胞を1.5mLの培地に再懸濁します。
- DNA in vitroトランスフェクション試薬とDNAプラスミドを含む培地を293T細胞に加え、37°Cで30分間インキュベー
トします。
- T175フラスコに移し、18 mLの培地を加えます。37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、細胞を剥がさずにガラスピペットで培地を慎重に吸引します。18 mLの新鮮な培地と交換します。インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
- ウイルス上清の採取
- 氷の上に置いたピペットを使用してウイルス上清を取り除きます。800 x gで5分間遠心分離し、細胞と破片をペレット化します
手記：細胞ペレットが大きい場合、上清が除去されたときに細胞がフラスコから破壊された可能性があります。これらの細胞は、新しいフラスコに新鮮な培地で再度播種することができます。
- 0.22 μmフィルターを使用してウイルス上清をろ過します。
- ウイルス上清はすぐに使用してください。.氷上または4°Cで最大24時間保管するか、-80°Cで冷凍して長期保存します。
2. 活性化ヒトT細胞のルシフェラーゼによる増殖と形質導入
- in vitroでのヒトT細胞の活性化
- 0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)と2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10 mLを滅菌15 mLチューブに加え、ビーズ(T細胞2個につきビーズ1個)を加え、マグネットラックに2分間入れてPBSを吸引
して、ビーズを洗浄します。
- ステップ1.1.1で説明したように培地を調製し、IL-2を最終濃度30 IU/mLまで添加し、洗浄したビーズを添加します。活性化するT細胞200万個ごとに2.5mLの培地を作ります。
- T細胞(精製したばかりのT細胞または以前に精製した細胞、凍結した細胞、解凍した細胞、洗浄した細胞)を、血球計算盤とトリパンブルー染色液を用いてカウントします。ステップ2.1.2で調製した培地にT細胞を添加し、チューブを静かに反転させて混合します。T細胞は、細胞の供給源と一般的な健康状態に応じて、少なくとも20倍に増殖します。マウスの治療に必要な数を計算し、20で割ることにより、活性化するT細胞の数を決定します。ここでは、予備実験に基づいて、マウスあたり20 x 106 T細胞を使用しました。
- 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに、200万個のT細胞、ビーズ、および(インターロイキン2)IL-2を含む培地2.5 mLをプレートに取ります。加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで培養します。
- 今後3日間、毎日20倍顕微鏡でT細胞を検査し、ルシフェラーゼを形質導入するタイミングを決定します。細胞が凝集して培地を枯渇させ、赤/ピンクから淡いオレンジに変わると、細胞の準備が整います。
- レトロネクチンプレートの調製
手記：レトロネクチンは、遺伝子導入を促進するため、形質導入に使用されるプレートをコーティングするために使用されます。
- PBS中の20 μg/mLレトロネクチンを2 mL未処理の6ウェルプレートのウェルに加えます。室温で2時間、または37°Cで1時間インキュベートします。形質導入するT細胞200万個につき1個のレトロネクチンコーティングウェルが必要です。
- プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引します。
- 6ウェルプレートのウェルあたり3 mLのPBS(滅菌ろ過済み)中の2% BSAを添加します。室温で30分間インキュベートします。
- スピノキュレーション
- プレートの底を傷つけずにBSAを吸引します。
- ウェルごとに3 mLのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを4°Cで一晩覆ったままにします。
- 1ウェルあたり2 mLのCBR-TDRルシフェラーゼウイルス上清(ステップ1.3で収集)を添加します。
- 1,240 x gで32°Cで90分間遠心分離します。
- 伝達
- T細胞を数えます。
- プレートの底を傷つけずにウイルス上清を吸引します。
- ウェルあたり200万個のT細胞を、30 IU/mLのヒトIL-2を含む6 mLのDMEMに播種します。
- T細胞を毎日検査します。T細胞は、ほぼコンフルエントになったとき、通常は2日後に増殖する準備が整います。
- 細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞をそっと洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9 mLの培地を添加し、フラスコあたり合計15 mLの培地を添加します。
- 翌日、さらに15 mLの培地を追加します。細胞は、この培地の添加の翌日にマウスに注入する準備ができているはずです。フローサイトメトリーを実施して、形質導入の成功を確認します(ルシフェラーゼコンストラクトには、PEチャネルに見えるTDトマトフルオロフォアが含まれています)。
>3. 免疫不全マウスにおけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の生着
- 注射用のT細胞を調製し、カウントします。
- フラスコからT細胞を取り出し、カウントします。細胞は、通常、活性化後7日目までに、20倍から30倍に拡大したときに注入する準備が整います。
- T細胞を800 x gで5分間遠心分離し、2 mLの培地に再懸濁し、マグネットラックを使用してビーズを除去します。
- T細胞を二重特異性抗体とは別に注入する実験では、T細胞をカウントし、最終濃度が培地100μLあたり2,000万T細胞になるように再懸濁します。ステップ 3.2 に進みます。ex vivoアームT細胞(EAT)を用いた実験の場合は、ステップ3.1.4に進んでください。
- ex vivoアームT細胞を用いた実験では、T細胞をカウントし、各グループごとに個別の1.5 mLチューブに分離し、マウスあたり2,000万個の細胞を使用します。例えば、マウス5匹ずつのグループが3つある場合は、それぞれ1億個のT細胞が入った1.5mLチューブを3本用意します。
- 1.5 mLチューブを800 x gで5分間遠心分離し、T細胞ペレットを乱さずに培地を慎重に取り出します。二重特異性抗体を含む50 μL以下の培地に再懸濁します。室温で30分間インキュベートします.
手記：本研究で実施した実験では、研究室で作製した独自のIgG-[L]-scFv T細胞関与型二重特異性抗体を使用しました。T細胞アーミングには、20 x 106 T細胞あたり5 μgの抗体を使用します。市販の二重特異性抗体も使用できます。
- 各チューブに1,450 μLの培地を添加して、余分な抗体を洗い流します。800 x gで5分間遠心分離し、培地を慎重に吸引し、培地100 μLあたり2,000万個の武装T細胞の濃度で再懸濁します。
- マウスへの注射と生着
- 1 L/min酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバーでマウスを麻酔します。マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔をかけられます
注意: 手順全体を通して熱サポートを提供します。
- 26Gの針を使用して、マウス1匹あたり100μLの培地に2,000万個のT細胞を眼窩逆方向に注入します。
- 1,000 U組換えIL-2を皮下投与して、in vivoでのT細胞の生存をサポートします。
- 二重特異性抗体を眼窩後(T細胞注射に使用されない眼内)または腹腔内に投与します。.マウスが麻酔から回復し、ケージに戻るのを待ちます。
注:ここでも、ラボで生成された独自の抗体が使用されましたが、代わりに市販の抗体を使用することもできます。ここでの実験では、1回の投与につきマウスあたり0.3〜10μgの抗体を投与しました。抗体は週に2回、3〜4週間投与されました。
>4. ルシフェラーゼ形質導入T細胞を生着させたマウスの生体内イメージング
>注:このステップはイメージングの日に行われるべきであり、これは必ずしもT細胞および/または抗体がマウスに投与されるのと同じ日ではありません。通常、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の投与から24時間後にイメージングを行います。
- D-ルシフェリンの調製
- 1 gのD-ルシフェリンを33.3 mLの滅菌PBS(最終濃度:30 mg / mL)に溶解します。.
- 溶解したD-ルシフェリンを33 x 1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、チューブを-20°Cに保ちます。
- イメージングの日に、イメージングする動物の数に対して十分な量の30 mg / mL D-ルシフェリンのアリコートを解凍します。10匹の動物には1本のチューブで十分です.
注:使用後は残りのD-ルシフェリンを再凍結してください。D-ルシフェリンは、少なくとも5回の凍結/融解サイクルで安定です。
- マウスへのD-ルシフェリンの投与
手記：マウスにD-ルシフェリンを投与する前に、イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化してください。カメラの冷却には数分かかる場合がありますが、これはマウスにD-ルシフェリンを注入する前に行うべきであり、これは、基板の投与後5分でイメージングが行えるようにする必要があります。
- 1 L/min酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバーで最大5匹のマウスを麻酔します。マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔されます。
- マウスが完全に麻酔されたら、マウスあたり100 μLの30 mg / mL D-ルシフェリン(マウスあたり3 mg)を26 G針による眼窩後注射で投与します。.D-ルシフェリンを次のグループに投与する前に、このマウスのグループをイメージしてください。前のグループが画像化されている間に、麻酔するイソフルランチャンバーにマウスの次のグループを置きます。
- ルシフェラーゼ形質導入T細胞のイメージング
- 麻酔をかけたマウスをイメージャーの遮光チャンバーに移動し、0.5 L / minで3%イソフルランを投与し続けます。異種移植片を支えている側面がカメラの方を向くようにマウスを横向きに置きます。マウスを仰臥位にして別の画像セットを撮影し、肺内のT細胞の存在を評価します。
- Acquisition Control Panelを使用して、発光、写真、オーバーレイを選択します。露光時間を自動に、ビニングを中、F /ストップを1に設定します。画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露光時間と一致するように露光時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。複数の露光時間で画像をキャプチャすると、ピクセル飽和なしで最も明るい信号を達成するための最適な露光時間を決定するのに役立ちます。
- マウスをイソフルランから取り出し、ケージに戻り、目が覚めて歩行できるようになるまで観察します。
- ステップ 4.2.1 の手順を繰り返して、すべてのグループのイメージ化を完了します。
