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1. 細胞と寄生虫の培養
- ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地に10%の熱不活化FBS(ウシ胎児血清)と抗生物質(100 U / mLペニシリンおよび100 μg / mLストレプトマイシン)を添加した25 cm2細胞培養フラスコで、American Type Culture Collection(CCL-7)のLLC-MK2(アカゲザル腎臓上皮)細胞を37°Cで5%二酸化炭素(CO2)で増殖させます。
- LLC-MK2細胞をTrypanosoma cruzi(Y株)に感染させるには、前のプロトコルに従ってください。
- LLC-MK2感染細胞の上清(5mL)を15mLの細胞培養コニカル遠心チューブに集め、500 x gで10分間、22°Cで遠心分離して細胞破片を減らします。チューブを37°Cで10分間保持し、トリポマスティゴテが上清まで泳ぐようにします。
- 上清を新しい円錐形のチューブに集め、22°Cで2500 x gで15分間遠心分離します。上清を捨て、寄生虫を含むペレットを完全なRPMI培地に再懸濁して、ノイバウアーチャンバー内の細胞をカウントして細胞密度を決定します。
2. 免疫蛍光プロトコールの制御
>注:一度固定すると、カバースリップを含むプレートを4°Cで1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.2)に1週間保存することができます。保存するためには、細胞が透過化ステップを経ていないことが重要です。
- LLC-MK2細胞(2 x 104)を、RPMI培地中の紫外線(UV)滅菌丸型カバースリップを含む24ウェルプレートに16時間沈殿させます。
- 感染細胞については、T. cruziを含む上清(項目1.4)を各ウェルに比例して(感染の多重度、MOI 10:1)加え、6時間の感染まで放置します。感染細胞と非感染細胞を含むカバースリップをPBS溶液で5回洗浄し、1x PBS(pH 7.2)中の2%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で10分間固定します。
- カバースリップを1x PBS(pH 7.2)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 0.2% IGEPAL CA-630 (オクチルフェノキシポリエトキシエタノール) を 1x PBS (PH 7.2) 中の RT で 10 分間、カバーガラス
を透過処理します。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- カバースリップをブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミン、BSA1x PBS、pH 7.2)と室温で30分間インキュベートします。
- マウスモノクローナル抗hnRNPA1(抗不均一性リボ核タンパク質-A1)(希釈1:200)またはブロッキング溶液で希釈したマウスポリクローナル抗TcFAZ(抗トリパノソーマ・クルージ鞭毛付着ゾーンタンパク質)(希釈1:100)抗体のいずれかを用いて、カバースリップをRTで30分間インキュベートします。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- Alexa Fluor 488(1:600)に結合したヤギ抗マウスIgG F(ab')2(H+L)とAlexa 594(1:300)に結合したファロイジンとともにRTでカバースリップを30分間インキュベートし、ブロッキング溶液で希釈した宿主細胞中のアクチンフィラメント(F-アクチン)を染色します。
- 1x PBS(pH 7.2)で3回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドの表面に、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)培地を含む少量のProLong Gold退色防止マウンティング試薬を塗布します。
- 鉗子を使用して、封入剤のカバーガラスを静かに傾け、気泡が形成されないようにします。乾いたら、必要に応じてカバースリップを密封します。
3. 同一宿主で産生したモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いた二重標識免疫蛍光法
- 上記の手順 2.1 から 2.6 を繰り返します。
- 感染細胞と非感染細胞を含むカバースリップを、自社製マウスポリクローナル抗TcFAZ抗体(1:100)と室温でブロッキング溶液で30分間インキュベー
トします。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- ブロッキング溶液で希釈したAlexa Fluor 647 (1:600) に結合したヤギ抗マウス IgG F (ab')2 (H+L) と共に、カバースリップを室温で 30 分間インキュベートします。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- ブロッキング溶液中で希釈したAffiniPureウサギ抗マウスIgG(H+L)(0.12 mg/mL)を室温で30分間使用して、2回目のブロッキングステップを実行します。
- カバースリップを1x PBS(pH 7.2)で3回、それぞれ5分間洗浄します。その後、マウスモノクローナル抗hnRNP A1 IgG2b抗体(1:200)と室温で30分間インキュベー
トします。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- Alexa Fluor 488に結合したヤギ抗マウスIgG2b抗体(1:600)と、ブロッキング溶液で希釈したAlexa 594に結合したファロイジン(1:300)とカバーガラスを30分間インキュベートします。
- カバースリップを1x PBSでそれぞれ5分間3回洗います。
- 上記の手順2.8から2.10を繰り返します。