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1. FPLC(Automated Fast Protein Liquid Chromatography)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製
>注: 次の手順は、通常、ほとんどの自動化システムに適用できます。精製は、室温または4°C(FPLCシステムを冷却室に保管している場合)で行うことができます。一連のスカウティングテストを実施して、適切なカラムマトリックス、結合バッファー、溶出バッファー、pHなどの最適な精製条件を特定し、コンディショニング培地から精製された抗体を最大限に回収することができます(結果のセクションを参照)。最適な条件は、精製する抗体またはタンパク質によって異なります。精製は、自動化されたFPLCシステムで行いました。精製は、5 mLのProtein Aカラムを使用して室温で行いました。
- 以下のバッファーを超純水で調製し、推奨pHに調整した後、0.22 μmのフィルターでろ過してください。
- 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M Na2HPO4、および0.001 M KH2PO4を混合して、pH 7.4(結合緩衝液)1 Lのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。必要に応じて、バッファーをろ過する前にpHを調整してください。
- 500 mLの0.1 Mグリシン-HCl pH 2.7(溶出緩衝液)を調製します。バッファーをろ過する前にpHを調整してください。
- 1 M Tris pH 9.0(中和緩衝液)50 mLを調製します。
- すべてのシステム電源とコンピューターとの通信接続が確立されていることを確認します。デバイスは、ソフトウェアの「システム制御」モジュールに表示される必要があります。UVセルが280nmの波長に設定されていることを確認します。オプション:接続して使用する場合は、pHメーターを校正します。
- A、B、サンプルポンプのインレットチューブを超純水に浸してシステムを洗浄します。チューブに空気がある場合、またはシステム内に空気が疑われる場合は、シリンジでポンプをパージします。システムを水で洗浄するには、システムコントローラーによる手動操作または自動操作を使用します。圧力、導電率、UV280 トレース、および pH が一貫しており、カラムの圧力限界がメーカーの仕様に従って超えていないことを観察します。
手記：異常は、先に進む前に対処する必要があるシステム内の空気または閉塞を示している可能性があります。
- システムコントローラーモジュールで、ポンプAを介して負荷(サンプルループをバイパス)または注入(サンプルループを経由)の位置で手動で1 mL/minの流量を開始し、カラムの接続を開始します。カラム位置インレットのシステムチューブを外し、カラムインレットに接続されているストッパーを取り外します。
- システムチューブからカラム上部の水滴に水が流れるようにしてから、システムチューブをカラムに取り付けます。カラムのインレットとインレットフィッティングに水滴があふれているため、気泡のない接続が保証されます。
- カラム出口を下流の出口に取り付け、すべてのフィッティングがしっかりと固定されていることを確認します。カラムをシステムに接続した状態で、カラムの仕様に概説されている最大圧力制限と流量の制限を超えないようにしてください。
- 5カラム容量(CV)の水でカラムを洗浄します。必要に応じて、UV280トレースが安定するまでカラム洗浄を続けます。
- Aのインレットチューブを結合バッファーに、Bを溶出バッファーに、サンプルポンプを結合バッファーに浸して、システムを正しいバッファーで平衡化します。手動操作でPumpWashを使用してインレットチューブにバッファーを充填します。
- ソフトウェアの「Method Editor」モジュールで、メソッドウィザードを使用して、使用するカラムのアフィニティークロマトグラフィーメソッドをセットアップします。
手記：自動FPLCシステムには、推奨設定(流量と圧力制限など)があらかじめ充填されたメソッドと、精製用に選択したカラム(メーカー、マトリックス、サイズ)に基づく実行ステップが付属しています。
- プロテイン A アフィニティークロマトグラフィーには、以下の実行ステップを使用します。
- 5 CVの結合バッファーでシステムを平衡化し、フロースルーを廃棄物容器に集めます。
- サンプルをカラムにロードし(ロードする容量はメソッドで手動で指定されます)、フロースルーを別のコンテナに収集します。
- 5 CVの結合バッファーでシステムを洗浄し、フロースルーを別の容器に集めます。
- Elution buffer を使用して 5 CV アイソクラティック分画を行った Elute カラムで、精製した抗体サンプルをフラクションコレクターによるフラクションとして収集します。
- 5 CVの結合バッファーでシステムを平衡化し、フロースルーを廃棄物容器に集めます。
- メソッドを設定したら、カラムに適用するコンディショニングメディアの量を指定し、メソッドを保存します。
手記：メソッドで指定される容量は、サンプル分析中に空気が混入しないように、実際の容量より5〜10 mL小さくする必要があります。このプロトコルで使用される指定容量は90〜120mlです。
- サンプルポンプチューブをコンディショニングされた媒体の入った容器に浸します。
- 指定された出口チューブを介してサンプルの流れを収集するために、別の容器を準備します.
手記： 分析中にエラーが発生した場合、またはカラムの結合容量を超えたためにフロースルーをカラムに再適用したり、精製を繰り返す必要がある場合には、フロースルーを回収することが重要です。
- フラクションコレクターにコレクションチューブを準備します。1 mLのフラクション容量あたり100 μlの中和バッファーを添加します。FPLCシステムは、フラクションをコレクションチューブに自動的に溶出します。
- ソフトウェアの「システム制御」モジュールで、実行するメソッドを開きます。
手記：メソッドの実行は、メソッドの変数のチェック、フラクションコレクターの設定、結果ファイル名と保存場所の定義を含む一連のページで開始されます。
- [開始] をクリックして実行を開始します。実行は「システム制御」モジュールで監視できます。
- 精製ランが完了したら、システムソフトウェアの「評価」モジュールで得られたクロマトグラムを確認します。
- すべてのタンパク質含有画分を別のチューブに結合し、分子量 30 kDa をカットオフした遠心フィルター装置を使用してバッファー交換を行い、PBS で濃縮します。メーカーの指示に従って遠心分離手順を実行します。
- 製造元の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)を使用して抗体濃度を測定します。
- 別の精製を実行する場合は、サンプルポンプチューブを結合バッファーでプライミングし、手順1.9〜1.14を繰り返します。
- 精製運転が完了したら、A、B、サンプルポンプのインレットチューブを超純水に浸し、ステップ3で行ったようにシステムとカラムを洗浄します。
- A、B、およびサンプルポンプチューブを20%エタノールに浸し、システムとカラムを保管するための洗浄手順を繰り返します。
- カラムを下流の出口から外してカラムストッパーを交換し、次にインレットでカラムを外してストッパーを交換し、チューブをシステムに再接続します。カラムは4°Cで保存してください。