成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

要約

出典:Ansorg, A., et al. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、成体海馬の神経新生を調べるために使用される免疫蛍光染色法を示しています。最初に、マウスの脳切片は、ニューロン前駆細胞のニューロン新生に関連するマーカータンパク質に向けられた一次抗体による治療を受けます。次に、蛍光色素でタグ付けされた二次抗体で標識します。次に、脳切片を共焦点顕微鏡で観察し、マーカータンパク質の異なる組み合わせの発現パターンに基づいて、前駆細胞のさまざまなサブタイプを区別します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 組織の準備

1. 灌流の前日に、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4に4%ホルムアルデヒドを調製します。4°Cで保存してください。
2. 深く麻酔したマウス (3.5% イソフルラン) を左心室を介して 10 ml の氷冷リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で経心灌流し、次に 40 ml の氷冷ホルムアルデヒド (流速 5 ml/分) で灌流します。脳を解剖し、同じ固定液で4°Cで24時間ポストフィックスします。
3. 脳を10%(4°Cで24時間)と30%のショ糖(脳が沈むまで、約48時間)に連続して移します。凍結するには、凍結保護された脳を-25°Cのイソペンタンにゆっくりと沈め、組織から泡が出なくなるまで浸します。-80°Cで保存してください。
4. 厚さ40 μmの冠状切片を凍結ミクロトーム(ブロック温度-25〜-16°C)で切断します。切片を24ウェル細胞培養プレートのウェルを含む不凍液に順次移します(図1を参照)。-20°Cで保存してください。

2. 免疫染色

>注:切片はフリーフローティングで処理され、通常はキャリアプレートとメッシュインサートを備えた6ウェルプレートで処理されます。例外として、ブロッキング、抗体インキュベーション、およびアビジン-ビオチン複合体(ABC)反応は、メッシュインサートのない12ウェルまたは24ウェルプレートで行われます(染色するスライスの数にもよりますが、ウェルあたり0.5〜1 mLで十分です)。これらの手順では、細いブラシを使用してセクションを移動します(新しい溶液ごとにすすいでください)。すべてのインキュベーションは、連続攪拌(最大150rpm)で行われます。

1. 免疫組織化学(ABC法)
   1. 不凍液から切片をトリスバッファー生理食塩水(TBS)に移し、十分にすすいで(4°CでO / Nを1回、室温[RT]で各10分間5回)、不凍液を完全に除去します。
   2. 内因性ペルオキシダーゼ活性を消光するには、TBS-Tween 20(TBS-T)で1.5%H₂O₂に30分間インキュベートします。必要に応じて、セクションをバブリングして再水没させることに注意してください。TBSで3回、各15分間すすぎます。
   3. オプション:その間、加熱キャビネットと2 N HClを37°Cに予熱します。DNAを変性させるには、切片を2 N HCl中で37°Cで30分間インキュベー
   トします。
   4. オプション:0.1 Mホウ酸緩衝液pH 8.5、RTで切片を10分間中和します。移載中に、ペーパータオルのセクションを含むメッシュインサートを短時間綿棒で拭き取り、HClの残留物を取り除きます。TBSで2回、各15分間すすぎます。
   5. TBSplusでインキュベートして組織を透過化し、RTで1時間非特異的抗体結合部位をブロックします。
   6. TBSplusで希釈した一次抗体、O/Nで4°Cでインキュベートし、TBSで3回、各15分間すすぎます。
   7. TBSplusで希釈したビオチン化二次抗体を室温で3時間インキュベートし、TBSで3回、各15分間すすぎます。その間に。。。
   8. 製造元のプロトコル(TBS-Tで1%A + 1%B)に従ってABC複合体を調製します。使用前にRTで30分間放置してください。AB試薬で切片をRTで1時間インキュベートし、TBSで3回、各15分間すすぎます。
   9. 6ウェルプレートまたは12ウェルプレートあたり50 ml 0.5 mg / ml 3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)をTBS-T中に調製し、2つに分割し、ウェルあたりそれぞれ4 mlまたは2 mlをピペットで使用します。セクションをDAB溶液に移します(注意!DABは有毒です。サプライヤーが提供する特定のMSDSに従ってください、つまり、白衣と手袋を着用し、化学ドラフトを使用してください)。
   10. 残りの25 mLのDAB溶液に0.5 mL 1% H₂O₂を加え、上記の容量を各ウェルに混合し、ピペットでピペットで動かして、ペルオキシダーゼ反応を開始します。12分間インキュベートします。TBSで3回、各15分間すすぎます。
   11. ゼラチンでスライドにセクションを取り付け、O/N.を恒久的な封入剤で覆います。
   12. オプション:カバースリップを置く前に対比染色します.
       手記：バックグラウンドが高いためにS/N比が低い場合は、AB試薬とのインキュベーション後にH₂O₂処理を繰り返します(ステップ2.1.8)。
2. マルチプル免疫蛍光
   1. 単一または同時の複数の免疫蛍光
      1. 不凍液からTBSに切片を移し、十分にすすいで(4°CでO / Nを1回、室温で10分間各5回)、不凍液を完全に除去します。
      2. オプション: ステップ 2.1.3 から 2.1.4 まで。
      3. TBSplusでインキュベートして組織を透過化し、非特異的な抗体結合部位をRTで1時間ブロックします。
      4. 一次抗体カクテル(例:ラットα-BrdU(ブロモデオキシウリジン)、モルモットα-DCX(ダブルコルチン)、ヤギα-GFP(緑色蛍光タンパク質))をTBSplus、O / Nで希釈し、4°Cでインキュベートします。TBSで各15分間3回すすぎます。
      5. 蛍光色素標識二次抗体(例:ローダミンレッドαラット、Alexa-647 αモルモット、Alexa-488 α-ヤギ、すべてロバ由来)をTBSplusで希釈し、室温で3時間、または4°CでO / Nでインキュベートします。これからは、セクションを光から保護します。TBSで3回、各15分間すすぎます。
      6. 切片をゼラチンでスライドに取り付け、一晩風乾します(O / N)。水性封入剤で覆います。
   2. 同じ宿主動物種由来の一次抗体を用いた逐次多重免疫蛍光法
      1. ステップ2.2.1.1〜2.2.1.3として。
      2. 最初の一次抗体(例:ウサギα-抗原A)でO/Nをインキュベートし、4°CでO/Nします。TBSで3回、TBS-Tで1回、それぞれ10分間すすぎます。
      3. 最初の蛍光色素標識二次抗体(例:Rhodamine Red-conj. donkey α-rabbit)で3時間RTでインキュベートします。これからは、セクションを光から保護します。TBSで3回、TBS-Tで1回、各10分間すすぎます。
      4. 一次抗体と同じ宿主由来の10%正常血清(例:ウサギ血清)で3時間RTインキュベートし、最初の二次抗体上のオープンパラトープを飽和させます。TBSで3回、TBS-Tで1回、各10分間すすぎます。
      5. TBSplusで、一次抗体の宿主(例:α-rabbit IgG(H+L))に対する50 μg/mlの非標識一価Fabフラグメントとインキュベートし、4°Cで2番目の二次抗体O/Nが認識できるエピトープをカバーします。
      6. TBSで少なくとも3回、TBS-Tで1回、それぞれ10分間すすぎます。転送中に、ペーパータオルのセクションを含むメッシュインサートを短時間綿棒で拭き取り、Fabの残りを取り除きます。
      7. 2番目の一次抗体(例:ウサギα-抗原B)でO/Nを4°Cでインキュベートし、TBSで3回、TBS-Tで1回、それぞれ10分間すすぎます。
      8. 2番目の蛍光色素標識二次抗体(例:Alexa-488-conj. ロバα-ウサギ)でインキュベートし、3時間RTします。TBSで各15分間3回すすぎ、上記のようにマウントしてカバースリップします
         手記：異なる宿主種由来の抗体で抗原を標識するには、ステップ2.2.2.2に抗原を追加し、ステップ2.2.2.3にそれぞれの二次抗体を追加します。

結果

図 1.ミクロトームスライスを24ウェルプレートに移す際の概略図。A1 から開始し、後続のスライスを行 A に配置します。A6 の後、次の行 B に移動します。D6に到達したら、A1に戻って続行します。このスライスの配置により、脳全体のn^番目のセクションごとに定量化できます。新生児細胞の定量化には、6^番目の脳切片(1列の内容に相当)ごとに採取します。免疫蛍光表現型解析では、12^番目の切片(1列の交互の2行の内容に相当)を取ります

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ティッシュの準備
イソフルラン-アクタビス	ピラマルヘルスケア	700211
パラホルムアルデヒド粉末(PFA)	リーデル・ド・ヘン	16005	有毒, 引火性
灌流ポンプ PD5206	ハイドルフ・インスツルメンツ	〒523-52060-00
Masterflex Tygon ラボ用チューブ、Ø 0.8 mm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	06409-13
給餌針、ストレート、21 G、オリーブチップ1.75 mm、40 mm	アグントス	1036
冷凍用ミクロトーム Microm HM 400	サーモフィッシャーサイエンティフィック
24ウェル細胞培養マルチウェルプレート	グライナーバイオワン	662160
免疫組織化学
ティファール・ビタキュイジーヌ・スチーマー	ティファール	VS4001
ネットウェル24mmポリエステルメッシュメンブレンインサート	コーニング	3479	6ウェル培養プレートにあらかじめロードされています
ネットウェル15mmポリエステルメッシュメンブレンインサート	コーニング	3477名	12ウェル培養プレートにあらかじめロードされています
Netwellプラスチック6ウェルキャリアキット	コーニング	3521	24 mmポリエステルメッシュメンブレンインサート用
Netwellプラスチック製12ウェルキャリアキット	コーニング	3520	15 mmポリエステルメッシュメンブレンインサート用
ベクタステインエリートABCキット	ベクターラボラトリーズ	PK-6100
DAB(3,3′-ジアミノベンジジン四塩酸塩水和物)	シグマ・アルドリッチ	D-5637	発がん性、光感受性
フルオロマウント-G	サザンバイオテクノロジー	0100-01
一次抗体
ウサギIgG1 α-Ki67
ウサギ用α-GFAP、AS-3-GF	ノボカストラ/ライカバイオシステムズ	NCL-L-キ67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; エピトープ検索が必要
ヤギIgG (H+L) α-GFP	シナプス系	173,002	09:20
マウス用IgG1 α-nestin	Acris 抗体と関連製品	R1091Pの	06:00
モルモットIgG (H+L) α-ダブルコルチン	アブカム	AB6142	1:200; エピトープ検索が必要
ラットIgG2a α-BrdU(腹水)	メルクミリポア	AB2253	09:20
ラットIgG2a α-BrdU(精製)	AbD セロテック/ バイオ・ラッド	OBT0030CX	BrdUの検出用。DAB 1:500/IF 1:400
マウスIgG1κ α-BrdU	AbD セロテック/ バイオ・ラッド	OBT0030	CldUの検出用。DAB 1:500/IF 1:250-400
マウスIgG1 α-NeuN	BDバイオサイエンス	347580	IdUの検出用。DAB 1:500/IF 1:350
二次抗体	メルクミリポア	マブ377	09:20
ロバαモルモットIgG(H + L)-ビオチン
ロバαラットIgG(H + L)-ビオチン	ダイアノバ	〒711-065-152	09:20
ロバαマウスIgG(H + L)-ビオチン	ダイアノバ	〒712-065-150	09:20
ヤギαラットIgG(H + L)-Alexa Fluor 488	ダイアノバ	〒715-065-151	09:20
ロバα-ヤギIgG(H + L)-Alexa Fluor 488	分子プローブ	A11006 (英語)	05:10
ロバαマウスIgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	分子プローブ	A11055 (英語)	05:10
ロバαマウスIgG(H + L)-Alexa Fluor 647	ダイアノバ	〒715-097-003	02:40
ロバαモルモットIgG(H + L)-Alexa Fluor 647	ダイアノバ	〒715-605-151	05:10
ロバαラットIgG(H + L)-ローダミンレッド-X	ダイアノバ	〒706-605-148	05:10
ロバα-ウサギIgG(H + L)-ローダミンレッド-X	ダイアノバ	〒712-295-150	05:10
ロバαモルモットIgG(H + L)-ローダミンレッド-X	ダイアノバ	〒711-295-152	05:10
ストレプトアビジン-ローダミンレッド-X	ダイアノバ	〒706-296-148	05:10
ヤギαウサギIgG (H+L)-AMCA	ダイアノバ	016-290-084	09:20
ヘキスト33342	ダイアノバ	111-155-144	1:250、ウサギα-GFAPでのみ動作
ダピ	分子プローブ	H3570-J	17:40
ブロッキング	分子プローブ	D1306	17:40
FabフラグメントロバαマウスIgG(H+L)
FabフラグメントロバαウサギIgG(H + L)	ダイアノバ	〒715-007-003	01:20
通常のロバ血清	ダイアノバ	〒711-007-003	01:20
通常のウサギ血清	メルクミリポア	S30
正常なヤギの血清	ダイアノバ	011-000-010
ウシ血清アルブミン	ダイアノバ	005-000-001
組織学	シグマ・アルドリッチ	A7906
クレシルバイオレット
ネオクリア	シグマ・アルドリッチ	C5042
ネオマウント	メルクミリポア	109843	無毒のキシレン代替品
顕微鏡	メルクミリポア	109016	永久封入剤
アクシオスコップ2
LSMの710	カールツァイス顕微鏡
	カールツァイス顕微鏡

名 名 名 名 (代表) 頃 の 頃 の の