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1. 動物の調理法
- 3%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけます。中腹部の上の領域に水平切開を行い、皮膚を引っ張って胸を開きます。他の臓器に穴を開けずに胸腔を開くために、別の切開を慎重に行います。
- 最初に心筋から心臓を灌流し、次に冷たく3%グルタルアルデヒドを心血管麻痺液(50 mM KCl、PBS中の5%デキストロース、表1を参照)で2分間使用して、心筋を完全に弛緩させます。.
- 氷冷した3%グルタルアルデヒドを0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)でさらに2分間灌流し、重力圧力を使用して、25G 5/8インチの針を使用して固定剤を心臓に導入します。心臓が固定剤でいっぱいになり始めた直後に、心臓の頂点を持ち上げ、心臓から1〜2 mmで下の血管を切断して圧力を緩和し、液体を排出します。
- 心臓を解剖し、心房を取り除き、心室をペトリ皿の氷冷した3%グルタルアルデヒド/ 0.1Mカコジル酸ナトリウムに落とします。.30〜60分の固定後にバタフライカットを作成し、3%グルタルアルデヒド/カコジル酸を含むシャーレに入れます(材料の表を参照)。グルタルアルデヒド/カコジル酸溶液中にある間に、1 mm3の小さな立方体に外科用ブレードを使用して心臓を切り刻みます。
- 解剖した心臓組織をグルタルアルデヒド/カコジル酸溶液に4°Cで24時間固定/浸漬します。
2. 心臓組織の処理
- 24時間の固定後、0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液で組織を20分間洗浄します。
- 以下の手順に従って、0.1 Mカコジル酸バッファーを調製します。
- 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を調製するには、カコジル酸ナトリウム(21.4 g)と1%塩化カルシウム溶液(3 mL)を90 mLの蒸留水に溶解して、1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液のストックを調製します。蒸留水を加えて溶液を100mLに増やします。溶液をよく攪拌し、一晩放置して溶質を溶かします。
- 次に、1 Mカコジル酸ナトリウム原液10 mLを取り、80 mLの蒸留水に加えます。HClを使用してpHを7.4に調整し、蒸留水を加えて最大100mLまで容量
化します。
- 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中でさらに20分間洗浄を繰り返し、カコジル酸ナトリウム緩衝液から組織を取り出し、室温で4時間2%四酸化オスミウム溶液に浸します。このプロセスは浸透と呼ばれます。
- 以下の手順に従って、2%四酸化オスミウム溶液を調製します。
- 2%四酸化オスミウム溶液を調製するには、4%四酸化オスミウム溶液、4 mL(材料表を参照)、1 Mカコジル酸ナトリウム原液(0.8 mL)、蒸留水(3.2 mL)を使用して、合計8 mLの溶液を作ります
手記：この全過程とこれからのステップは、ドラフト内で行わなければなりません。
- 浸透後、組織を2%酢酸ナトリウム溶液に室温で10分間浸します。
- 4 gの酢酸ナトリウムを20 mLの蒸留水に溶解して、2%酢酸ナトリウム溶液を調製します。
- 次に、組織を2%酢酸ウラニル溶液に室温で1時間浸します。
- 4 gの酢酸ウラニルを20 mLの蒸留水に溶解して、2%酢酸ウラニル溶液を調製します。
- 酢酸ウラニル染色後、表2に記載されている順序で、等級付けされたアルコールとアセトンを通じて組織を順次脱水します。
3. 心臓組織の埋め込み
- 以下の手順に従って、脱水組織を低粘度エポキシ樹脂に埋め込みます。
- 低粘度エポキシ樹脂を作るには、10.24 mLのビニルシクロヘキセンジオキシドエポキシモノマー、6.74 mLのポリプロピレングリコール(DER 732)のジグリシジルエーテル、および30.05 mLの無水コハク酸コハク酸(NSA)(材料の表を参照)を50 mLのチューブに混合します。懸濁液を手で2分間よく攪拌します。
- 2-ジメチルアミノエタノール(DMAE、材料の表を参照)エポキシ促進剤を18滴加え、懸濁液を攪拌して成分を完全に混合します。
- 次の混合物の順序で組織をエポキシ樹脂に含浸させます。
- 100%アセトンを1:1樹脂(アセトン懸濁液)に交換し、室温で1時間組織を浸します。
- 1:1樹脂:アセトン懸濁液を6:1樹脂:アセトン懸濁液に交換し、組織を3時間浸します。
- 最後に、6:1樹脂:アセトン懸濁液を100%樹脂懸濁液に交換し、組織を室温で一晩浸しておきます。
- 組織を8mmのマイクロモールド(材料の表を参照)で新鮮な樹脂に入れ、埋め込まれた組織を70°Cで一晩硬化させます
手記：硬化後にレジンが硬く、でももろくないことを確認してください。
>4. ウルトラミクロトームを用いた組織切片
- レジンブロックをティッシュで1 mm以下にトリミングしてから、ウルトラミクロトームに取り付けます(材料の表を参照)。ウルトラミクロトームのセグメント化されたアームに型をできるだけ正確に置き、サンプル型をダイヤモンドナイフに向かって手動で進めます。
- Histoナイフ(材料表を参照)で切片を500nm(1/2ミクロン)の厚さで切断し、EMループツールを使用してそれらを持ち上げてスライドガラスに置きます。
- スライドガラスをトルイジンブルーステイン用のホットプレートに置き、関心のある領域を見つけます。
- 対象領域を見つけたら、Ultra 45°ナイフ(材料表を参照)を使用して、淡い金色の極薄切片(100 nm)を作成します。これらの極薄セクションを200メッシュの銅グリッドの鈍い面に配置します。
5. 極薄心臓切片染色
- 染色を開始するには、エッチング溶液、すなわち5%メタピヨウ酸ナトリウム溶液を用いて抗原のマスキングを解除します。
- 蒸留水に500 μLの5%メタ過ヨウ酸ナトリウム溶液(材料表を参照)を調製します
手記：使用前に新しい溶液を準備してください。
- 20 μLのメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液をきれいなパラフィンフィルム上に置きます。完全に乾燥したグリッドと組織切片をエッチング溶液の液滴上に置きます.
手記：ティッシュセクションのあるグリッドの鈍い側は、エッチング溶液の方を向いている必要があります。
- セクショングリッドを溶液上に室温で30分間放置します。
- エッチングされたティッシュ切片を蒸留水の液滴に60秒間置いて洗浄します。
- 0.05 Mグリシン溶液の液滴上にセクショングリッドを室温で10分間配置することにより、残留アルデヒドをブロックします。グリッドの端を濾紙で拭き取り、残留グリシン溶液を取り除きます。
- 1x PBS(pH 7.4)の1 mLに3.75 mgのグリシンを溶解して、0.05 Mグリシン溶液(材料表を参照)を調製します。
- 切片グリッドを10-20 μLのブロッキング溶液に室温で25分間入れます
手記：ブロッキング溶液の組成:2 μL の 1% 正常ヤギ血清 (NGS) + 20 μL の 1% BSA (最終濃度: 10%) + 178 μL の 1x PBS (pH 7.4) で最終容量を 200 μL にします。
- グリッドエッジを濾紙でブロットし、グリッド切片を抗体希釈液に置き、室温で10分間コンディショニングします。
- グリッド切片を一次抗体(この場合はSigmar1、材料表を参照、抗体希釈液で1:10に希釈)と加湿チャンバーで1時間30分間インキュベートします。
- グリッドをブロット乾燥させ、抗体希釈液でグリッド切片を5分間ずつ2回洗浄します。
- グリッド切片をビオチン化二次抗体(この場合はビオチン化ヤギ抗ウサギポリクローナル二次抗体、表参照、抗体希釈液で1:10に希釈)と加湿チャンバー内で1時間インキュベー
トします。
- グリッドをブロット乾燥させ、抗体希釈液でグリッド切片を5分間ずつ2回洗浄します。
- 市販のストレプトアビジン標識QD(QD655 nm、Table of Materialsを参照、抗体希釈液で1:10に希釈)のグリッド切片を、室温の加湿チャンバーで1時間インキュベートします。チャンバーをアルミホイルで覆うことにより、光への曝露を防ぎます。
- グリッドの端を濾紙で拭き取り、グリッド部分を水滴の上に置いて2分間洗います。
- グリッドの端を拭き取って乾かします。
>表1:組織脱水に使用されるPBSおよびその他の溶液の組成。
グラム
| バッファ | 組成 | 量 |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)(1 L) | 塩化ナトリウム | 8グラム |
| 塩化カリウム | 0.2グラム |
| リン酸二塩基性ナトリウム | 1.44 |
| リン酸カリウム一塩基性 | 0.24グラム |
| pHを7.4に調整します | |
>表2:組織脱水症に対する等級付きアルコールとアセトンの適用(ステップ2.5)
| コンポーネント | 時間 |
| 50%エタノール | 10分間 |
| 70%エタノール | 10分間 |
| 95%エタノール | 10分間 |
| 100%エタノール | 20分 |
| 100%エタノール | 20分 |
| アセトン100% | 30分 |
| アセトン100% | 30分 |