腎臓の3次元イメージングのためのホールマウント臓器染色技術

要約

出典:Hasegawa, S., et al. Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオでは、CUBIC(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis)と呼ばれる組織透明法と免疫蛍光染色を用いたマウス腎臓の全量染色のアッセイを実演しています。腎臓は組織清浄に供され、腎臓は脱脂され、脱色され、屈折率マッチング溶液で処理されて組織を透明にし、最適な3次元イメージングを実現します。組織を蛍光標識抗体で染色し、ライトシート顕微鏡下で組織内の交感神経と動脈を明らかにします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の準備と腎臓の固定

1. 以下の手順で灌流固定を行います。
   1. イソフルラン(3%、2.0 L / min)の吸入および塩酸メデトミジン(0.3 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)、およびミダゾラム(4 mg / kg)の腹腔内投与によりマウスに麻酔をかけます(材料の表を参照)。
   2. 20 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)と30 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝液(PB)で心臓の左心室から動物に灌流します。
2. 灌流固定と腎臓サンプリングの直後に浸漬固定を行います。
   1. 腎臓を4°Cで4%PFAにさらに16時間浸し、PBSで2時間(3回)洗浄します9(図1).
      注意：ホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有毒な刺激物です。試薬は、適切な個人用保護具を備えたドラフトで取り扱ってください。

2. 脱色と脱脂

1. Triton X-100 10 wt% と N-ブチルジエタノールアミン 10 wt% からなる脱色および脱脂のための CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) を調製します (材料の表を参照)。
2. CUBIC-Lによる脱色・脱脂は、以下の手順で行ってください。
   1. 固定腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-L(水とCUBIC-Lの1:1混合物)に14 mLの丸底チューブ(材料表を参照)に浸し、室温で6時間静かに振とうします(図2A)。次に、14 mLの丸底チューブに7 mLのCUBIC-Lを浸し、37°Cで5日間穏やかに振とうします。
   2. このプロセス中は、CUBIC-Lを毎日更新してください。脱色および脱脂プロセスの後、腎臓をPBSで室温で2時間(3回)洗浄します(図1)。サンプルの取り扱いには分注スプーンを使用します(図2B)。

3. ホールマウント免疫蛍光染色

1. 染色バッファーを調製します。
   1. 0.5%(v/v)Triton X-100、0.5%カゼイン(PBS)、および0.05%アジ化ナトリウムを混合して、一次抗体用の染色バッファーを調製します。
   2. 0.5%(v/v)Triton X-100、0.1%カゼイン(PBS)、および0.05%アジ化ナトリウムを混合して、二次抗体用の染色バッファーを調製します。
2. 一次抗体による染色を行います。
   1. 脱脂した腎臓を一次抗体(1:100または1:200、材料表参照)の染色緩衝液中で37°Cで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します
      手記： 1つの腎臓に必要な染色緩衝液の量は500〜600μLです(図2C)。
   2. 0.5%(v/v)Triton X-100をPBS(PBST)溶液で室温で1日間洗浄します(図1)。
3. 二次抗体による染色を行います。
   1. 二次抗体(1:100または1:200、材料表を参照)を染色バッファー中で37°C、7日間穏やかに振とうしながら腎臓を免疫染色します。腎臓をPBSTで室温で1日間洗浄します(図1)。
   2. 固定後、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒド(37%ホルムアルデヒドとPBの1:36混合物)に3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します(図1)。

4. 屈折率 (RI) マッチング

1. CUBIC-R+を用意します。
   1. 45 wt%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリンと30 wt%のニコチンアミドを混合して、CUBIC-Rを調製します(材料の表を参照)。
   2. 屈折率(RI)マッチングのためにCUBIC-R +を調製するには、以前に発表された報告に従って、0.5 v%のN-ブチルジエタノールアミンをCUBIC-Rに添加します。
2. RI マッチングを実行します。
   1. 腎臓を50%(v / v)CUBIC-R +(水とCUBIC-R +の1:1混合物)の7 mLに14 mLの丸底チューブに浸し、室温で1日間穏やかに振とうします。.次に、14 mLの丸底チューブに7 mLのCUBIC-R+を浸漬し、室温で2日間穏やかに振とうします(図1)
      手記：腎臓は、RIマッチングの開始時には50%CUBIC-R+で浮遊しますが、プロセスの終了時にはCUBIC-R+で沈み込み、透明になります(図2D)。

>5. 画像の取得と再構成

1. 画像取得中(RI = 1.51)(図3)に、RIに適合した腎臓をシリコンオイル(RI = 1.555)と鉱物油(RI = 1.467)(55:45)の混合物に浸します。
2. 特注のライトシート蛍光顕微鏡で腎臓全体の3D画像を取得します(材料の表を参照)。すべての生の画像データを 16 ビット TIFF 形式で収集します。3Dレンダリングされた画像を画像解析ソフトウェア(Imaris、資料表参照)で視覚化し、キャプチャします。

結果

図1:組織透明化とホールマウント免疫蛍光染色。CUBICによる組織透明化は、脱脂質化(CUBIC-L)と屈折率(RI)マッチング(CUBIC-R+)の2段階のプロセスです。ホールマウント染色は、脱脂プロセスの後に行われます。スケールバー= 10 mm。画像はHasegawa et al.より転載しています。

図2:ハンドリングプロセスの画像。(A)サンプルを14 mLの丸底チューブに封入した7 mLの50%または100%CUBIC-Lに浸漬します。チューブは、脱脂プ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14 mL丸底高透明度PP試験管	隼	352059	ティッシュのクリアリング、染色、洗浄
2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリン	東京化学工業	D1876	キュービック-R+
37%-ホルムアルデヒド溶液	ナカライ・テスク	16223から55	固定後
4%-パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液	ナカライ・テスク	09154から85	腎臓固定
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG抗体	インビトゲン	A-21436	二次抗体 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG 抗体	インビトゲン	A-31573	二次抗体 (1:200)
抗アクアポリン2(AQP2)抗体	アブカム	ab199975 (英語	一次抗体 (1:100)
抗ポドシン抗体	シグマ・アルドリッチ	P0372	一次抗体 (1:100)
抗ナトリウムグルコース共輸送体2(SGLT2)抗体	アブカム	ab85626	一次抗体 (1:100)
抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体	アブカム	AB113	一次抗体 (1:100)
抗α-平滑筋アクチン(α-SMA)抗体	アブカム	AB5694	一次抗体 (1:200)
PBS中のブロッカーカゼイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	37528	染色バッファー
酒石酸ブトルファノール	明治	5526	麻酔剤
C57BL/6NJcl	日本バイオサプライセンター	該当なし	マウス系統
イマリス	ビットプレーン	該当なし	イメージング解析ソフトウェア
マクロズーム顕微鏡	オリンポス	MVX10	特注顕微鏡の観察ユニット
メデトミジン塩酸塩	共立製薬	8656	麻酔剤
ミダゾラム	サンドーズ	27803229	麻酔剤
鉱油	シグマ・アルドリッチ	M8410	浸漬油
N-ブチルジエタノールアミン	東京化学工業	B0725	キュービック-L、キュービック-R+
ニコチンアミド	東京化学工業	N0078	キュービック-R+
ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100	ナカライ・テスク	12967-45	キュービックL、PBST
シリコンオイルHIVAC-F4	信越化学	50449832	浸漬油
アジ化ナトリウム	和光	〒195-11092	染色バッファー