皮膚生検切片中のα-シヌクレイン凝集体を検出するための免疫蛍光アッセイ

要約

出典: Vacchi, E., et al. Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオは、皮膚生検切片上の神経変性疾患特異的α-シヌクレイン凝集体を検出する免疫蛍光アッセイを示しています。フリーフローティング免疫染色は、真皮ニューロンのカルボキシル末端加水分解酵素とα-シヌクレイン凝集体を蛍光標識するために使用されます。共焦点顕微鏡下では、両方の抗体から蛍光を発する細胞は、真皮ニューロンにα-シヌクレイン凝集体が存在することを示しています。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 皮膚生検コレクション

1. 資格のある医師に、適切な臨床環境で皮膚生検を行わせてください。
2. 皮膚生検を行う領域を選択し、アルコール綿棒で洗浄します。
3. 1ccのリドカイン2%で麻酔薬溶液を調製します。
4. 針をその領域と平行にして、局所麻酔を皮下注射します。
5. 麻酔の効果を確認した後、3mmの使い捨てパンチを取り、回転して繊細な下向きの圧力を加え、表皮と真皮を通って下向きに回転させ、皮下脂肪に到達します。
6. パンチを引っ込めます。
7. 使い捨ての鉗子を使用して、皮膚の栓をそっと引き上げます。
8. はさみを使用して、脂肪組織のレベルで標本の基部を切り取ります。
9. 10 mLの過ヨウ素-リジン-パラホルムアルデヒド(PLP)固定液が入ったチューブに検体を入れます。
10. その領域を消毒し、絆創膏で覆います。

2. 組織の固定と保存

1. 新しいPLP固定液を調製します(表1を参照)。
2. 皮膚生検の採取後すぐに、10 mLのPLP固定液が入ったチューブに浸し、4°Cで一晩(O / N)インキュベートします。
3. 翌日、ドラフトの下でPLP固定剤を静かに取り出し、同じチューブ内で、生検を5 mLの0.1 M Sorensen溶液で5分間3回洗浄します(表1)。
4. Sorensen溶液を廃棄し、5 mLの凍結保護溶液O / Nと生検を4°Cでインキュベー
トします。
5. クライオトームによる切開が1週間以内に行われる場合は、生検を4°Cで保存し、切開が3か月以内に行われる場合は、生検を-20°Cで保存し、生検をクライオモールドに埋め込み(ステップ3.2-3.4)、-80°Cで保存して、長期間保存します。

>3. クライオトームで組織をカット

1. クライオトームを-20°Cに設定します。
2. クライオモールドを取り、クライオ埋め込み培地で満たします。バブルの作成は避けてください。
3. ピンセットを使用して、縦軸(表皮-真皮)をクライオモールドの底部と平行にして、生検をクライオ包埋培地
に浸します。
4. サンプルを液体窒素でスナップ凍結して、生検を正しい方向に含んだクライオ包埋培地の固体キューブを得ます。
5. サンプルをクライオスタットに入れ、生検が順応するまで30分待ちます。
6. サンプルをクライオスタットに固定し、50 μm切片を切断します。
7. 小さなブラシを使用して、各ウェルに200μLの不凍液が入った96ウェルプレートにクライオ切片を移します。井戸ごとに1つのセクション。
8. -20°C.
   で保存してください 手記： 生検全体を分析しない場合は、部分的にのみカットします。この場合、切片は-20°Cで保存し、生検の残りの部分は-80°Cで保存して、長期間保存する必要があります。

4. 免疫蛍光染色

1. 96ウェルプレートに100μLの洗浄液を入れます。
2. 分析する切片を保存プレートから洗浄液が入った新しい保存プレートに移します。各ウェルごとに1切片(解剖学的部位ごとに4切片、患者1人につき4切片:通常は患者1人あたり合計12切片)。
3. 切片を室温(RT)で10分間洗浄液に入れておきます。切片を同じ溶液を含む別のウェルに移し、洗浄を繰り返します。
4. 切片を100 μLのブロッキング溶液を含む新しいウェルに移し、RTで少なくとも90分間、最大4時間インキュベー
トします。
5. 一次抗体である抗PGP9.5(ウサギポリクローナル、1:1000)および抗5G4(マウスモノクローナル、1:400)をワーキング溶液で希釈します。
6. 切片を一次抗体のワーキング溶液100 μLを含む新しいウェルに移し、RTでO/Nインキュベートします。
7. ステップ4.3として、切片をRTで少なくとも10分間2回、100μLの洗浄液で洗浄します。
8. ワーキングソリューション中の5G4(1:700)を検出するには、Goat anti-RabbitのGoat anti-Rabbitを希釈します(異なる蛍光色素と結合します)。
9. 切片を、二次抗体のワーキング溶液100 μLを含む新しいウェルに室温で90分間移します。この点から、96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、二次抗体と結合した蛍光色素の漂白を防ぎます。
10. ステップ4.3として、切片を100μLの洗浄液で少なくとも10分間2回洗浄します。
11. 切片を100 μLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、リン酸緩衝生理食塩水[PBS] 1xで1:5,000に希釈)を含む新しいウェルに室温で5分間移します。
12. ステップ4.3として、切片を100μLの洗浄液で少なくとも10分間2回洗浄します。
13. スライド上のセクションを正しい位置に取り付けて、折り畳みを間違えないようにします。
14. 封入剤をスライドに数滴加え、カバースリップで覆います。
15. 共焦点/蛍光顕微鏡を使用する前に、スライドでO / Nを乾かしてください。
16. スライドは、光にさらされないように4°Cの適切な箱に保管してください。正確に保存されている場合、信号は約6か月間表示されます.
    手記： 新たに切断されたスライスを含む96ウェルプレートから洗浄溶液を含む96ウェルプレートへの切片の移し替え(ステップ4.1)は、生検をピックアップするのに役立つ小さなブラシを使用して行われます。切片を最初のウェルに移した後、スライスを異なる溶液でインキュベートする必要があるたびに、ブラシを使用してウェルからウェルへと移動します。

5. 免疫蛍光イメージング

1. 倒立蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡(20倍、40倍、またはそれ以上の倍率、最良の結果を得るには、Zスタックプランで2μm刻みの連続フレームを使用します)で切片を表示します。
2. 顕微鏡に接続されたカメラで画像を取得
3. 適切なイメージングソフトウェア(ImageJなど)を使用して、信号の空間分布と強度の観点から正の信号をセクション分析します。これを行うには、以下の手順を実行します。
   1. ImageJソフトウェアでファイルを開きます。
   2. [Image (画像)] をクリックして>各カラーチャネルを解析>チャネルを分割します。
   3. 「Z プロジェクトのスタック>イメージ」をクリックして>複数のセクション取得のマージを取得します。
   4. 「イメージ」をクリックして>カラーチャネル>結合し、同じ取り込みの異なるカラーチャネルを結合します。

>表 1: 必要な解決策。プロトコルに必要な解決策のリストと、その準備方法の簡単な説明。

不凍液 (4°Cで最大6か月間保存)	30%グリセロール 30%エチレングリコール 30% dH2O 10% 2x リン酸バッファー
ブロッキングソリューション (現時点で準備中)	4% ノーマル ヤギ セラム 1% トリトン X-100 洗浄液で
凍結保護剤 (4°Cで最大6か月間保存)	20%グリセロール 80% ソレンセンのソリューション
リン酸水素二ナトリウム溶液 (RTで最長6ヶ月間保存可能)	0.45Mリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)dH2O 滅菌ボトルでろ過します
リジン溶液 (4°Cで最大3週間保存)	0.3M L-リジン一塩酸塩溶液の50% 0.1Mソレンセン溶液の50% pH 7.6 pH 7.4、滅菌ボトルでろ過
パラホルムアルデヒド(PFA)8% (ドラフトの下に準備し、4°Cで最大1か月間保管します)	dH2O中の2.6M PFA(ギ酸の形成を避けるために55°CまでC_do 60°Cを超えないように) 滅菌ボトルでろ過します
リン酸緩衝液 2x (4°Cで最大6か月間保存)	6%リン酸ナトリウム(NaH2PO4)溶液 dH45O中のリン酸二ナトリウム(Na2HPO4)溶液
PLP固定液 (現時点では、ヒュームフードの下に準備してください)	25% パラホルムアルデヒド 8% 0.01M 過ヨウ素酸ナトリウム (メタ 75%リジン溶液
リン酸二水素ナトリウム一水和物 (RTで最長6ヶ月間保存可能)	0.52M リン酸二水素ナトリウム一水和物 (NaH2PO4*H2O) in dH2O 滅菌ボトルでろ過します。
ソレンセンの解決策 (4°Cで最大1ヶ月間保存)	2.5%リン酸ナトリウム溶液 18.7%リン酸二ナトリウム溶液 pH 7.6、dH2O
洗浄液 (現時点で準備中)	0.25M トリズマベース 0.26M NaCl pH 7.6、dH2O
ワーキングソリューション (現時点で準備中)	50%ブロッキングソリューション 50%洗浄液

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5G4(抗ヒトαSyneclein 5G4)	Analytik イエナ ロボスクリーン	847-0102004001	マウスモノクローナル
AlexaFluor 488 ヤギ抗ウサギIgG	インビトゲン	1971418	2mg/ミリリットル
AlexaFluor 594ヤギ抗マウスIgG	インビトゲン	1922849	2mg/ミリリットル
リン酸水素二ナトリウム溶液	メルクミリポア	106586
エチレング リコール	シグマ・アルドリッチ	324558
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G7757
L-リジン一塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	L5626
パラホルムアルデヒド	アルドリッチケミストリー	441244
PGP9.5	アブカム	AB15503	ウサギポリクローナル
塩化ナトリウム	シグマ	S3014
リン酸二水素ナトリウム一水和物	メルクミリポア	106346
ナトリウム(メタ)過ヨウ素酸塩	シグマ・アルドリッチ	S1878
トリズマベース	シグマ	T1503
トライトンX-100	シグマ・アルドリッチ	X100
ベクタシールド	ベクターラボラトリーズ	H-1000	封入剤