蛍光媒介断層撮影法を使用してマウスの腸の炎症を評価する

要約

出典: Nowacki, T. M., et al. Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Mouseine Intestinal Inflammation. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、蛍光媒介断層撮影法(FMT)を使用して、大腸炎のマウスモデルにおける腸内マクロファージ浸潤を評価する技術を示しています。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を介してマウスに大腸炎を誘発すると、結腸に浸潤したマクロファージ上のF4/80糖タンパク質マーカーを認識する抗体が動物に注射されます。次に、マウスをFMTデバイスで画像化し、蛍光信号と反射率信号を3次元画像に再構成して、蛍光の空間分布と強度を決定します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 材料と実験のセットアップ

1. 動物の世話。
   1. 体重20〜25 gの任意のDSS感受性系統(例:.、C57BL/6)の性別および年齢を一致させたマウスを使用してください。
   2. 実験グループごとに少なくとも5匹以上のマウスを計画し、地域の動物管理ガイドラインに従ってマウスを飼育します。
   3. 標準的なげっ歯類の食事とオートクレーブされた飲料水を自由に提供します。
   4. 標準的なチャウを取り外し、スキャンの少なくとも3日前にアルファルファフリーのチャウと交換して、管腔内自己蛍光を減らします。
2. 急性DSS誘発性大腸炎の誘発。
   1. 2 g の DSS (分子量 ~40,000 Da) をオートクレーブ滅菌した飲料水 100 mL に溶解し、2% (w/v 溶液) を得ます。
   2. マウスの飲用供給量のみをDSS溶液で満たし、マウス1匹あたり1日あたり5mLの液体を推定します。コントロールマウスにDSSなしで同じ飲料水を提供します.
      手記：実験が終了するまで、マウスを毎日監視します。初期体重の20%以上を失ったマウス、または瀕死の状態になったマウス(つまり、持続的な猫背姿勢、動きの低下、呼吸困難、著しく直立したコート)は、動物福祉に関する地域の適用ガイドラインに従って安楽死させます。
3. 蛍光媒介断層撮影法の調製。
   1. 目的の抗体(例:ラット抗マウスF4/80)を蛍光色素(例:Cyanine7、λ_励起:750 nm、λ_放出:776 nm)で標識します。精製した抗体を適切な透析膜(細孔径<50-100 kDa)で、0.15 M塩化ナトリウム1 Lに対して少なくとも2時間または一晩透析します。
      1. 抗体を1Lの0.1 M NaHCO₃に移し、少なくとも2時間透析します。
      2. 必要量の蛍光色素をジメチルスルホキシド(DMSO)(10.8 μL/mgの抗体)に溶解し、抗体溶液に添加します。蛍光色素を20倍モル過剰に使用して、色素とタンパク質の比率を1:3にします。
      3. 暗所4°Cで1時間インキュベートし、1 Lの0.15 Mナトリウムに対する透析またはPD-10脱塩カラムを使用して非標識抗体を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で分離してin vivoアプリケーションに使用します。
      4. 分光光度法により、最終的な抗体濃度と標識比率を決定します。
      5. 250-330 nmの吸収でタンパク質濃度を測定し、色素による追加の吸収を考慮してください。シアニン標識のために、280 nm(タンパク質)での最大吸収を750 nmでの最大吸収(次のステップ)の11%で修正します(次のステップ)。
      6. 250〜800 nmで化合物の希釈率(通常は1:10)を測定し、750 nmでCyanine7の濃度を抽出します。
      7. 色素とタンパク質の比率を次のように決定します:色素/抗体=750 nmでの最大吸収 / 200,000 / (280 nmでの最大吸収 - 0.11 x 750 nmでの最大吸収) / 170,000。
      8. 抗体溶液を4°Cに保ち、光から遮蔽して、注入前に漂白を防ぎます。
   2. 注射の直前に必要な量の抗体溶液を滅菌シリンジに装填し、使用するまで光から遮ってください。
   3. プローブ注入の最適なタイミングとスキャン手順を、トレーサーの薬物動態に応じて決定します。
   4. 1.5〜2.5%の吸入イソフルランを酸素中で使用してマウスに麻酔をかけるか、標識された抗体の尾静脈注射専用の拘束具にマウスをしっかりと入れます。
   5. 完全長抗体の場合、マウス大腸炎における抗マウスF4/80マクロファージの可視化など、スキャンの少なくとも24時間前に標識抗体を注入してください。マウスを尾静脈を介して静脈内(i.v.)に、2.0 nmolの色素に対応する量の標識抗体を
   注入します。
   6. 同等に標識された非特異的抗体(例えば、ラットIgGまたは一次抗体遺産に対応する別のアイソタイプ)を、特異的プローブと同等の用量のアイソタイプコントロールとして使用します。
      手記：コントロール化合物の注入後のin vivoスキャンの結果は、特定のプローブイメージングデータの解釈の参照として役立つことができます。
   7. 電気カミソリを使用して腹部の動物の毛皮を剃り、光の反射と吸収を最小限に抑えます。

2. 技術設備

1. 小動物用蛍光には、獣医用蛍光媒介断層撮影(FMT)装置を使用します(図1)。
2. 「new study」ボタンをクリックしてプロジェクトごとに新しいスタディを作成し、将来の参照のためにイメージングパラメータや線量など、関連するトレーサーをスタディの説明に含めます。
3. このスタディ内では、それぞれのスタディデザインに従ってスタディグループを作成します(例:特定のトレーサーと非特異的アイソタイプコントロール)「new study group」ボタンをクリックしてください。各研究グループにそれぞれの動物の数を装備させます。
4. トレーサーコンストラクトのシステムを調整します。
   1. トレーサーの各バッチのキャリブレーションを実行して、ラベリングのばらつきを正規化し、OIデータからの定量的測定を可能にします。
   2. 各システムのキャリブレーションについては、機器メーカーのガイダンスに従ってください。「add new tracer」を選択すると、システムから手順のガイドが提供されます。適用した抗体溶液の希釈と、プローブ中のトレーサーの計算された絶対濃度を提供します。
   3. FMTの場合、定義された厚さと吸収特性(重要な組織に類似)の組織模倣ファントムを使用し、使用する抗体溶液の特定の容量で満たします。FMTデバイスでこれを測定します.
      手記： システムは、提供されたプローブの参照測定値と特定の濃度を使用して、将来のin vivo測定からトレーサーの絶対濃度を計算します。
5. 温度42°Cの加熱可能な検査カセットを使用してください
   手記： これにより、検査中にマウスが低体温になるのを防ぎます。

3. 動物麻酔

1. マウスに麻酔をかけるには、1.5 - 2% vol% イソフルラン ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) と 1.5 L O₂/min の連続流を使用します。げっ歯類の麻酔用に特別に設計された吸入システム(イソフルラン気化器)を使用して、麻酔薬の深さを簡単に制御し、スタッフの曝露を最小限に抑えます。
2. マウスを漏れ防止の誘導チャンバーに入れ、イソフルラン供給用の気化器をオンにします(100%(v / v)、5 vol%酸素中、3 L / min)。マウスが横たわって意識を失うまでマウスを監視します。
3. トモグラフィー用の検査カセットに入れ、ノーズコーンを介して100% v/v、酸素中1.5 vol%、1.5 L/minの用量で連続的にイソフルランを吸入し、検査中の動きのアーチファクトを最小限に抑えます。5分以上続く処置の場合は、角膜の損傷を防ぐためにマウスの目に眼軟膏を塗布します。
4. 反射神経をチェックして麻酔の深さを評価します。マウスを仰向けに置きます。麻酔が十分であれば、マウスは向きを変えてはいけません。マウスをつま先の間にそっとつまみます。麻酔が十分であれば、脚は引き抜かれません(外科的耐性の段階)。

>4. 蛍光媒介トモグラフィースキャン

>注:必要に応じて、この研究で使用したFMTシステムに固有の次の詳細(材料の表を参照)を代替の蛍光反射イメージングデバイスまたはFMTシステムに適応させます。

1. 麻酔をかけたマウスを背中に乗せて、検査カセットに入れます。
2. スキャン手順を実行します。
   1. カセットをイメージングシステムに挿入し、すぐに閉じて継続的な麻酔を確保します。以前に作成した研究グループから適切なサンプルを選択します。ドロップダウンメニューから投与されたトレーサーを選択し、トレーサー濃度の値が適切に計算されていることを確認します。
   2. スキャン計画に適した波長(Cyanine7の場合は720 nm)で蛍光反射率画像を取得し、「画像を取得」ボタンをクリックしてスキャンフィールドの概要を説明します。
   3. スキャンフィールドが蛍光反射率画像にオーバーレイとして表示されることを確認します。関心のある領域(結腸や腹部など)に合わせて調整し、空気や毛皮が残っている領域を避けます。画像ターゲットに応じて、右側のメニューでスキャンフィールドの解像度を粗いものから中程度、細かいものまで選択して、スキャンフィールド内の画像データポイントの数を設定します。
      手記： 細かいスキャンフィールドを使用すると、空間分解能が向上する可能性がありますが、スキャン時間が大幅に長くなることに注意してください。
   4. 「scan」をクリックして、選択した波長でデータ/画像の取得を開始します。
      手記： 腹部全体の中細スキャンのスキャン時間は約5分です。このとき、各データポイントは励起レーザーによって個別に照らされ、結果として得られる蛍光が記録されます。
   5. スキャンの最後に動物をイメージングカセットから取り出し、動物が完全に回復するのを待ってからケージに戻します。
   6. 実験中のさまざまな時点(例:0日目、5日目、9日目から10日目(実験終了時))で必要と思われる場合はFMTを繰り返しますが、体内に抗体が蓄積するため、バックグラウンド蛍光シグナルが増加することも考慮してください。

>5. データの再構築と解釈

1. それぞれのイメージングソフトウェアの再構成ツールを使用して、生のイメージングデータから蛍光分布の3Dマップを作成します。スキャン時に「再構成キューに追加」機能を選択すると、スキャンが自動的に再構成ツールに追加されます。
   1. それ以外の場合は、それぞれのスタディおよびスタディグループの下のドロップダウンメニューからスキャンを選択し、スキャンを右クリックして、[再構築に追加]を選択します。
2. さらに解析を行うには、データセットを解析ソフトウェアにロードします。トップバーのドロップダウンメニューから、それぞれの研究を選択し、右側のメニューから研究グループと個々の動物を選択します。この動物に対して実行されたすべてのスキャンが表示されます。正しいスキャンを選択し、「ロード」をクリックします。
   手記：トレーサー分布の3D再構成は、最初に取得した蛍光反射率画像のオーバーレイとして左側に表示されます。モデルは回転させたり拡大したりして、分析を容易にすることができます。
3. 再構築された3Dマップ上で非特異的な標識蓄積の病巣(肝臓や膀胱など)を特定し、標的組織(腸や腸など)と区別します。
4. 上部のバーから、ターゲットに最も適したROI形状を選択します。分析ソフトウェアにそれぞれの測定ツールを配置することにより、ターゲット組織を関心領域(ROI)として標識します。このソフトウェアは、ROIの蛍光強度と、スキャンがキャリブレーションされたトレーサーの(ピコ)モル量を提供します。
5. 炎症性浸潤物(組織学)と相関する疾患活動性の評価に最も適した同等物として、ROIサイズで正規化された適切なROIのトレーサーの総量を選択します。
   手記：ROIの他の特徴は、必要に応じて、特定のモデルの代表として選択できます。

結果

図 1.マウス大腸炎におけるマクロファージ浸潤の断層撮影視覚化。

FMTスキャンを大腸マウスおよび非大腸マウスの対照にCyanine7-conjugated antibody against mouse F4/80 (n = 5 per group)投与しました。(A)棒グラフ:ROIで色素の全蛍光強度をpmolで決定し、SEM±示しました。代表的な画像は、特定のプローブ(抗マウスF4/80)(B)と非特異的コントロール(ラットIgG)(C)を注入したマウスの炎症浸潤の程度に対応する色分けされた蛍光強度で示されています。どちらの場合も、同じサイズのROIを上腹部に横方向に配置して、さらに分析しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
アルファルファフリーダイエット	Harlan Laboritories、マディソン、米国	2014
Bepanthen目の軟膏	バイエル、レバークーゼン、ドイツ	80469764
デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)	TdB Consulatancy, ウプサラ, スウェーデン	DB001
エオシン	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, ドイツ	E 4382
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, ドイツ	E 9884
フローレン 100V/V	アボット、ヴィースバーデン、ドイツ	B506
ヘマトキシリン	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, ドイツ	HHS32-1L
O.C.T.ティッシュテックコンパウンド	Sakura, Zoeterwonde, オランダ	4583	組織学的分析のための固定剤
リン酸緩衝生理食塩水、PBS	ロンザ、ヴェルヴィエ、ベルギー	4629
塩化ナトリウム0.9%	ブラウン、メルズンゲン、ドイツ	0411/05/12211095
重炭酸ナトリウム粉末	Sigma Aldrich Deisenhofen(ドイツ)	S5761
標準的な食事	アルトロミン、ラーゲ、ドイツ	1320
ティッシュテッククライオモールド	さくら、ライデン、オランダ	4566名
ヘモカルト(グアヤック紙テスト)	ベックマン・コールター(ドイツ)	3060
ビオチンラット抗マウス抗F4/80抗体	セロテック、オックスフォード、英国	MCA497B
ビオチンラット抗マウス抗GR-1	BD Pharmingen、ハイデルベルク、ドイツ	553125
ストレプトアビジン-Alexa546	Molecular Probes、ダルムシュタット、ドイツ	S-11225	最大励起/発光:556/573nm
抗CD11bラット抗マウス抗体TC	カルテグ、バーリンゲーム、アメリカ	R2B06
精製された抗マウスF4/80抗体	BioLegend、ロンドン、英国	123102
ダピ	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	D9542
FITC標識抗Ly6Cラット抗マウス抗体	BD Pharmingen、ハイデルベルク、ドイツ	553104
FACSバッファ	BD Pharmingen、ハイデルベルク、ドイツ	342003
Cy7 NHSエステル	GEヘルスケアヨーロッパ、フライブルク、ドイツ	PA17104
MPOエリサ	Immundiagnostik AG、ベンスハイム、ドイツ	K 6631B
Cy5.5標識抗マウスF4/80抗体	BioLegend、ロンドン、英国	123127	ready-to-use 標識抗体(代替試薬)
抗マウスF4/80抗原PerCP-シアニン5.5	eBioscience、ウォルサム、米国	45-4801-80	ready-to-use 標識抗体(代替試薬)
DMSO(ジメチルスルホキシド)	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	67勝68敗5
イソフルラン	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	792632
エタノール	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	64勝17敗5
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	A4612の
トリス緩衝生理食塩水(TBS)	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	SRE0032
備品
FACS Calibur フローサイトメトリーシステム	BD Biosciences GmbH、ハイデルベルク、ドイツ
FMT 2000 In Vivoイメージングシステム	PerkinElmer Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	FMT2000
True Quant 3.1 イメージング解析ソフトウェア	PerkinElmer Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	に含まれるもの FMT2000
ライカDMLB蛍光顕微鏡	Leica, 35578 Wetzlar, ドイツ	DMLB
バンデリンソノパルスHD 2070	Bandelin, 12207 ベルリン, ドイツ	HDの2070	超音波ホモジナイザー
使い捨てメスNo10	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	Z692395-10EA
メッツェンバウムハサミ 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH、ガイスリンゲン、ドイツ	22398330
ルアーロックシリンジ 5mL	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	Z248010
シリンジニードル	Sigma-Aldrich、ダイゼンホッフェン、ドイツ	Z192368
ファルコンチューブ 50ml	BD Biosciences、Erembodegem、ベルギー	352070

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