サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. カスタム配列レイアウトの設計と作成
- 対応する対立遺伝子コールを持つペプチド配列のスプレッドシートを生成します。配列には 20 行と 30 列があり、ペプチドの最大 20x30=600 スポットを保持できます。ステップ1.5で記録されたペプチドの総数に応じて、また、私たちが試した2つの例に関する過去の経験に基づいて、600スポットアレイは~2つの別々の移植症例から生成されたすべての配列を保持することができます。
- ペプチドのセットをアレイの600スポットフォーマットに収めるための最も効率的な方法を合理的に計画します。
- 複数の被験者が 1 つの配列全体に収まる場合は、最初のドナーのシーケンスの後に空の行を挿入して、30 で割ることができる行の総数 (配列上の行のスポットの数) に一致させます。
- 最初のシーケンスセットの最後の空白行の直後に、2 番目の移植ケースのシーケンス内容の列全体を貼り付けます。
- 配列がいっぱいになり、600 スポットを超えずにケースを追加できなくなるまで、これらの手順を繰り返します。空の行全体が下部に埋められる場合は、空の行を 2 つのドナー セットの間に配置するように "移動" します。ケース間に残されたこの広いスペースは、合成の完了後にメンブレンの切断を容易にします - ステップ2.2に続く。以下に。
- 配列レイアウトのコンテキストでペプチド配列をプログラムします。SPOTシンセサイザーのプログラムは、ステップ1.1.4の結果のスプレッドシートを単純なテキストドキュメントとして保存することで直接取得できるシーケンスのテキスト形式(1行、1ペプチド配列)を取ります(対立遺伝子名、aa位置などの余分な列はありません)。
- SPOTシンセサイザーを介して自動ペプチドアレイ合成を実行します。合成の全操作については、Kudithipudiらに詳述されています。2つのアレイのFmoc合成には4~5日かかることに注意してください。
>2. 個々の移植レシピエントの時系列から抗血清をプローブし、再プローブします。
>注:600スポットメンブレンアレイの寸法は~7 cm x 13 cmです。合成後、アレイは直射日光から遮蔽され、乾燥膜として室温で少なくとも2年間保存できます。メンブレンは、繰り返し使用しても寿命を保つために、過度に折りたたまれないようにしてください。
- メンブレンアレイをエタノールで再水和し、Ponceau Sで染色したペプチドスポットを可視化します。
- ペプチドを運ぶメンブレンアレイを、Liらで最適化された段階的な手順に従って再水和します。
- アレイメンブレンを20mLの100%エタノールに浸します。
- 蒸留水20 mLを加えて溶液を50%エタノールに希釈し、室温で15分間インキュベー
トします。
- 浸漬液を40mLの100%水に3回交換し、毎回15分間インキュベートします。
- 適切な作業緩衝液、例えば、TBST(0.1%含有のトリス緩衝生理食塩水)20mLで、それぞれ5分間、3回洗浄します。
- 合成ペプチドを可視化するためのアレイのPonceau S染色
- 調製済みのPonceau S溶液20 mLを水和アレイに直接加え、振とうしながら~30秒間インキュベートします。
- 蒸留水をメンブレンに連続的に流して、背景のポンソーSカラーを落とします。その過程で、赤色のペプチドスポットが見えるようになることがあります。
- ドナーごとに配列の部分を分離し、個々のケースの配列のセクション間を慎重に切り取ります。各配列の向きをマークします。
- プレブロック配列。
- TBSTバッファーに溶解した5%脱脂乳20mLでメンブレンをブロックします。このミルクベースの溶液は、ポンソーSの色をさらに脱汚します。最も鮮明なペプチド画像を得るために、ミルクバッファーを数回交換します。
- 記録保持の目的で、ハンドヘルドカメラを使用してアレイのPonceau S画像の写真を撮ります(図1の例)。
- 5%脱脂乳中のメンブレンを4°Cで一晩または室温で2時間揺さぶりながらブロッキングを続けます。
- アレイを移植用抗血清とインキュベートします。
手記：プロゾーン効果またはフック効果として知られる現象は、血清抗体分析における補体依存性の干渉から生じる可能性があることに注意してください。この問題を回避するために、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)または血清サンプルの熱不活性化のいずれかを使用して、オプションの血清前処理ステップを検討できます。
- ブロッキングバッファーを取り外し、メンブレンを20 mLのTBSTで翌日3回、毎回5分間洗浄します。
- レシピエントの粗血清20 μLをTBSTバッファー中の2.5%牛乳20 mLに加え、メンブレンと室温で2〜3時間インキュベートします。この最初の調査ラウンドでは、時系列で最後の移植後血清(またはおそらく最も感作された血清)を最初に使用することをお勧めします。これは、シリーズの初期の標本、特に移植前の時点からの標本は、時間の経過とともに発生する傾向がある同種抗体の種類が少ないという仮定に基づいています。このようにして、プローブラウンド間の「キャリーオーバー」によるシグナル干渉の可能性は、移植片に対する免疫応答による真に発達した同種抗体反応性と明確に区別できます。
- TBST20 mLを使用してアレイを洗浄し、二次抗体とインキュベートします。
- メンブレンを毎回10分間3回洗浄します。
- ヤギ抗ヒトIgG-HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)二次抗体と1:10,000希釈で、TBSTバッファーに1%ミルクを添加してさらに2時間インキュベー
トします。
- ブロットを洗浄して現像します。
- メンブレンをTBSTで3回、毎回10分間洗浄します。
- 5 mLのルミノール溶液を新たに混合し、5 mLの過酸化物溶液を使用して増強化学発光(ECL)を行い、メンブレンを発達させます(1分間)。
- 適切なイメージャー(ChemiDoc Imaging SystemsまたはAzure C600など)を使用してECL信号を可視化します。
- ブロットをスキャンして定量します。
- 現像した画像(図2下画像)を保存し、スポット強度の定量化を行います。
>3. 臨床時系列全体で抗血清反応性を比較します。
- アレイを取り除きます。
- この時点で、メンブレンは常に濡れたままにしてください。
- 市販のストリッピングバッファー20 mLと37°Cで20分間インキュベートしてメンブレンをストリッピングし、その後、メンブレンをTBSTで3回、それぞれ10分間洗浄します。次に、異なる時点で採取した患者の異なる血清を使用して、ブロッキング(ステップ3.2)およびプローブ(ステップ3.3)ステップを繰り返します。
- ブロックストリップメンブレン。
注:ストリッピング後、メンブレンは、時系列で同じ患者からの異なる血清の別のラウンドのプローブに再利用できます。
- 前と同様に5%ミルクバッファーを使用してメンブレンをブロックします(ステップ2.2を参照)。
- 同じ時系列から異なる抗血清を再プローブします(2.3〜2.6のステップを繰り返します;図2、上の画像の例).
手記：その後、ストリッピングされたアレイを使用して、別の血清検体を再プローブできます。ペプチドはメンブレンの支持マトリックスに共有結合しているため、アレイは性能を損なうことなく、最大20ラウンドのストリッピングおよびリプロービングサイクルで再利用できることを示しました。
