プリンテッド糖鎖アレイによる循環型抗糖鎖抗体の検出

要約

出典:Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-Carbohydrate Antibodies in Small Animals.J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、マウス血清中の循環抗糖鎖抗体を解析するためのプリンテッド糖鎖アレイ技術を実演しています。血清中の抗体はチップ上の特定の糖鎖と相互作用し、免疫染色とそれに続く蛍光スキャンによって確認されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. グリコチップの生産

1. マイクロアレイの準備
   1. 300 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 8.5) 中の糖鎖 (50 mM) と多糖類 (10 μg/mL) を 6 回繰り返し、非接触ロボットアレイ装置(液滴量 ~900 pL)を使用して N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体化スライドガラス上に印刷します。各スライドには、6回繰り返されるサブアレイの4つの異なるブロック(図1A、色)が含まれています。各サブアレイは、コントロール(8行×14列)を含む112の異なる糖鎖スポットによって形成されています(図1B)
      手記：糖鎖関連情報を表1に示します。マイクロチップのプリンティングに使用される糖鎖ライブラリーは、IBChチームの長期にわたる合成努力の結果です。合成の例は、関連資料に記載されています。糖鎖ライブラリーには、血液型抗原や最も頻繁に出現する末端オリゴ糖のほか、哺乳類の N 結合型および O 結合型糖タンパク質や糖脂質のコアモチーフ、腫瘍関連糖抗原、病原菌由来の多糖類が含まれていました。
   2. スライドを水分ボックス(相対湿度~70%)で室温(25°C)で1時間インキュベー
   トします。
   3. ブロッキングマイクロアレイ:スライドをブロッキングバッファーと共に室温(100 mMホウ酸、25 mMエタノールアミン、0.2%(v/v)Tween-20超純水)で1.5時間インキュベートします。
   4. グリコチップを超純水で洗い、空気乾燥させます。
2. グリコチップの品質管理
   1. 複合免疫グロブリン調製物(CIP、免疫グロブリン含有:IgG、IgM、IgA)の1 mg/mL溶液、二次抗体としてのビオチン化ヤギ抗ヒト免疫グロブリンの10 μg/mL溶液(IgM + IgG + IgA)、続いて対応する蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートの1 μg/mL溶液(以下で説明するプロトコルを使用、ステップ2を参照)を使用して、各バッチから2つのマイクロアレイを分析します。
   2. グリコチップをスキャンして解析します(ステップ3、グリカンアレイの解析を参照)。
   3. チップ内およびチップ間の相関が0.9を超えるマイクロアレイバッチを使用します。

2. 糖鎖配列技術

1. 以下の水溶液(超純水)を調製し、室温(25°C)で保存します。
   1. バッファー-1:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)、1%(v / v)Tween-20および0.01%(w / v)アジ化ナトリウム(NaN₃)。
   2. バッファー-2:PBS中の1%(w/v)BSA、0.1%(v/v)Tween-20および0.01%(w/v)NaN₃。
   3. バッファー-3:0.1%(v / v)Tween-20のPBS中。
   4. バッファー-4: 0.001% (v/v) Tween-20 (PBS)。
2. グリコチップとサンプル調製
   1. スライドが入った収納ボックスを、室温(25°C)になるまでテーブルの上に置きます。
      手記：パウダーフリーのラテックス手袋を使用してください。グリコチップは、バーコードが配置されているスライドガラスの底部で操作する必要があります。バーコードは、グリカンが印刷された表面との接触を避けて、右側を識別するのに役立ちます。
   2. 箱を開けてグリコチップを取り出し、チャンバー内の湿度を一定に保つために湿った濾紙ですでに調整されているインキュベーションチャンバー(25°C)に入れます。
   3. その間、マウス血清を1.5 mLチューブ内のBuffer-1(1:20)で希釈します。血清溶液(5秒)をボルテックスミキサーで均質化します。
      手記：1つのグリコチップ表面を完全に覆うのに必要な容量は約1 mLです。
   4. 均質化後、希釈した血清を水浴中で37°Cで10分間インキュベートし、免疫グロブリンの凝集を防ぎます。チューブを10,000 x g、25°Cで3分間遠心分離し、上清を回収し、沈殿物を廃棄します。
   5. グリコチップをインキュベーションチャンバーに注意深く入れます。グリコチップ表面に残留する物質を除去するために、1 mLのBuffer-3と共に25°Cで15分間インキュベートします。
   6. グリコチップを垂直位置に保持し、プラスチック製のパスツールピペットを使用してBuffer-3を数滴垂らして再洗浄します。濾紙を使用してグリコチップ表面から緩衝液を慎重に取り除きます。

3. 反応:抗体の結合

1. グリコチップをインキュベーションチャンバーに入れます。希釈した血清サンプルをマイクロピペットを使用してグリコチップ表面に広げます。オービタル撹拌(30 rpm)で37°Cで1.5時間インキュベートします。グリコチップ表面のすべての乾燥領域が、ピペットの先端を使用して希釈した血清サンプルで覆われていることを確認してください。
2. 余分なサンプルを取り除き、グリコチップをBuffer-3に25°Cで5分間浸します。次に、グリコチップをバッファー-4の入った容器に移し(5分)、最後にグリコチップを超純水で洗浄(5分)します。グリコチップを175 x g、25°Cで1分間遠心分離し、液体を除去します。

4. 検出:二次抗体

1. グリコチップをインキュベーションチャンバーに入れます。Buffer-2中のビオチンに結合したヤギ抗マウス(IgG + IgM)の溶液(5 μg/mL)をグリコチップ表面に広げます。オービタル攪拌(30 rpm)で37°Cで1時間インキュベートします。
2. 結合していないフラクションを取り出し、洗浄手順を繰り返します。
3. 遠心分離後、グリコチップを暗所25°Cで45分間(30 rpm)インキュベートし、対応する蛍光色素標識ストレプトアビジン溶液(Buffer-2中)2 μg/mLとインキュベー
トします。
4. 暗闇の中で、結合されていない画分を取り除き、洗浄手順を繰り返します。
5. グリコチップを空気乾燥させます。
   手記：グリコチップはできるだけ早くスキャンする必要があります。しかし、染色後すぐにスキャンを行うことが不可能な場合は、グリコチップを暗闇の涼しく乾燥した場所に保管することができます。

3. 糖鎖配列の解析

1. アレイのスキャン
   1. グリコチップを暗所で室温に達するまでテーブルの上に置いておきます。同時に、スライドスキャナーとレーザー(励起波長633nm)の電源を入れます。
   2. マイクロアレイを保持し、グリコチップを背面に触れるまでスロットにスライドさせます。
   3. グリコチップをスキャンし(「Easy Scanを実行」)、スキャンを.TIFF」ファイル。

表 1: 糖鎖のリスト、BALB/c マウス (n = 20) の天然循環抗体 (IgM + IgG) への糖鎖のリスト、相対蛍光単位 (RFU) で MAD の中央値として表される ±、およびカットオフ (≥4000 RFU) を超える動物の数。この表は、Bello-Gil, D. et al. この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

結果

図1:糖鎖アレイの構成、印刷、および分析の概略図(縮尺ではありません)。(A)プリンティングされたマイクロチップは、419種類の糖鎖構造のライブラリーを用いて開発され、その後、適切な蛍光標識された二次抗体で検出されます。各スライドには、サブ配列の 4 つの異なるブロック (色) が含まれており、6 回繰り返されます。すべてのサブアレイは、コントロールを含む 112 の異なるグリカン スポット (8 行 × 14 列) によって形成されます。(B)蛍光スキャナーを用いたマイクロチップスキャンから得られた画像の代表例(画像の第3部)。(C)「グリッド」をすべてのサブアレイのスポットに整列させるプロセス(定量化中のテンプレート調整)。(D)各スポットの蛍光を検出し、結...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体
ビオチン化ヤギ抗ヒトIgs	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国	リファレンス #: 31782
ビオチン化ヤギ抗マウスIgM + IgG	サーモフィッシャーサイエンティフィック	参照 #: 31807
備品
ロボットアレイ機 sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG、ベルリン、ドイツ	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
ステイントレイ(スライドインキュベーションチャンバー)	Simport, Beloeil, QC, カナダ	リファレンス #: M920-2
遠心機	エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ	品番 #: 5810 R
ピペット	ギルソン、ミドルトン、ウィスコンシン州、米国	http://www.gilson.com/en/Pipette/
スライドスキャナー	PerkinElmer, ウォルサム, マサチューセッツ州, USA	ScanArray GXプラス
振とうインキュベーター	コール・パーマー、スタッフォードシャー、イギリス	リファレンス #: SI50
生体試料
BALB/cマウス血清	この論文	該当なし
複合免疫グロブリン製剤(CIP)	Immuno-Gem、モスクワ、ロシア	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
化学薬品、試薬、糖鎖
糖鎖ライブラリー	Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), モスクワ, ロシア	該当なし
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス、	リファレンス #: A9418
エタノールアミン	シグマ・アルドリッチ	リファレンス #: 411000
Tween-20 (トゥイーン 20	Merck Chemicals & Life Science S.A.(スペイン、マドリード)	参照 #: 655204
ホスパフテ緩衝生理食塩水(PBS)	VWR International Eurolab S.L, バルセロナ, スペイン	品番 #: E404
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	Ref. #: S2002
ストレプトアビジン Alexa Fluor 555 コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	リファレンス #: S21381
ストレプトアビジンCy5コンジュゲート	GEヘルスケア、リトルチャルフォント、バッキンガムシャー、英国	参照 #: PA45001
料
N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体化スライドガラスH	Schott-Nexterion、イェーナ、ドイツ	参照 #: 1070936
Whatman濾紙	シグマ・アルドリッチ	参照 #: WHA10347509
1.5mLチューブ	エッペンドルフ	参照 #: 0030120086
ソフトウェアとアルゴリズム
ScanArray Expressマイクロアレイ解析システム	パーキンエルマー	http://www.per kinelmer.com/microarray

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