抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

1. 配列スライドとソースプレートのレイアウトの設計

1. ArrayNinjaインターフェースの「スライドレイアウトの計画」見出しの下で、使用しているマイクロアレイプリンターに対応するリンクをクリックします
   手記：ArrayNinjaは、一般的に使用される2つのマイクロアレイプリンターのロボットの動きを模倣するようにプログラムされています(表1を参照)。他のアレイとの互換性は、ご要望に応じて構成できます。
2. [Load plate] ダイアログボックス内をクリックし、「empty」と入力して [Enter] をクリックします。ArrayNinja デザインモジュールのスクリーンショットについては、図 1 を参照してください。
3. スポット径を275 μm、スポット間隔を375 μmに調整します。残りの設定(Plate Blocks/plate row、Total plate Rows、replicates、features in y、Super Arrays、SuperA fudge;図1参照)を調整して、マイクロアレイスライド上の特徴の表示方法をカスタマイズします。
   手記：スポット径は、マイクロアレイピンのサイズによって決まります。これらの設定が調整されると、漫画のスライドはリアルタイムで更新されます。この漫画を使用して、各設定が最終的なスライドレイアウトをどのように変更しているかをプレビューします。
4. スライド上のフィーチャのレイアウトが完成したら、一意の各フィーチャにマウス ポインターを合わせ、ポップアップ ダイアログ ボックスにフィーチャ識別子を入力します。
   手記：フィーチャ識別子は、数字、文字、または組み合わせで構成できます。これは一意のフィーチャにのみ必要であり、反復が選択されているときにはダイアログ ボックスは表示されません。
5. すべての一意のフィーチャに識別子が割り当てられたら、[入力]をクリックします。スライドレイアウトの名前を入力し、[プレートを印刷]をクリックして保存します。新しいページが開き、選択したスライドデザインを作製するために必要な384ウェルソースプレートの数と、ソースプレートにロードされる各フィーチャーの物理的な位置をマッピングする表が表示されます。
   手記：この名前は、マイクロアレイ データを解析するときにこの設計を思い出すために使用されるため、覚えておいてください。「プレートを印刷する」をクリックすると、ArrayNinja内にレイアウトが保存されます。

2. マイクロアレイの作製

1. ソースプレートの準備
   1. ArrayNinjaで生成されたマップを使用して、384ウェルソースプレートを作成します。
      注:このプラットフォームでクエリされたペプチドの詳細な説明は、他の場所にあります。
   2. 各フィーチャー(ビオチン化ヒストンペプチドなど)の1〜2 μLを384ウェルソースプレートの正しいウェルに沈殿します
      手記：ビオチン化ヒストンペプチドは、通常、200〜400 μMのストック溶液から堆積します。これは、ペプチドの10〜25倍のモル過剰分が、単一のアレイスポットのストレプトアビジン結合部位に蓄積されることを意味します。これは、次の式を使用して計算されます:
      
      ここで、Vはピンによって供給されるボリューム、[P]は印刷されるフィーチャの濃度、NAはアボガドロ数、Sはスポットの表面積です。Cはスライドのカバレッジで、単位面積あたりのストレプトアビジン分子の数に3を掛けた値(利用可能なストレプトアビジン結合部位の平均数)で表されます。VとCはそれぞれのメーカーが入手しています。その他の特徴は、混雑が懸念される可能性のある生体分子のサイズに応じて、異なる濃度を必要とする場合があります。新しいタイプのフィーチャごとに、さまざまな印刷濃度を経験的にテストして、最適な印刷濃度を決定する必要があります。
   3. 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した1xプリンティングバッファーで各フィーチャーを10倍に希釈します。ソースプレートを500 x gで室温で2分間回転させます
      手記： フルオレセイン標識ビオチン(5 μg/μL)をプリンティングバッファーに含めることは、スポッティングコントロールとして、また分析中の適切なアレイアライメントを促進するための視覚的な補助として推奨されます(図3を参照)。
2. 印刷プロトコル(図2A – B)。
   1. 廃棄物収集容器を空にし、洗浄液容器と加湿器容器に滅菌蒸留水を満たして、アレイアーを準備します。
   2. ArrayNinja(図1)のスライドの設計に使用するパラメータを、マイクロアレイプリンタ制御プログラムに入力します。
   3. マイクロアレイプリンター制御プログラムを使用して、1回の浸漬で1秒の洗浄手順を設定します。各洗浄後にピンを5回再浸漬するように、洗浄後の設定を設定します。湿度を60%に設定します.
      手記： 最適な洗浄構成は、使用するマイクロアレイプリンターによって異なる場合があります。最適なポストウォッシュピンディップ構成は、使用するマイクロアレイプリンターによって異なる場合があります。
   4. 機能化されたスライド(ストレプトアビジン被覆ガラスなど)を基板プラテンに挿入し、すべてのプラテンをプラテンエレベータに配置します。ソースプレートをプレートホルダーに挿入し、ソースプレートエレベータに配置します。
   5. 「印刷」をクリックします。フィーチャーの堆積を数回行う印刷プロセスを監視して、すべての洗浄とディップの設定が正しいことを確認します。プリントが完了したら、アレイから基板プラテンを取り外します.
      手記：大規模なプリントランによりブロッキングステップを1日以内に完了できない場合は、プリントされたスライドを4°Cの加湿チャンバーで一晩インキュベートできます。ラップで密封された段ボール箱の中の小さな水のビーカーの隣にスライドをインキュベートします。
   6. スライドをブロッキングバッファーで室温で30分間混合しながらブロックします。
   7. スライドを室温で10分×2回、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.6)で混合しながら洗浄します。マイクロアレイスライド遠心分離機で室温で30秒間回転させてスライドを乾燥させます。
      手記：一度に多数のスライドを処理するには、ハイスループットの顕微鏡スライド洗浄チャンバーを使用して、50枚のスライドを並行して洗浄できます。
   8. ワックスで分割するように設計されたスライドの場合は、セクション2.1に進みます。他のすべての設計では、スライドを光や湿気から保護する4°Cで保存してください。
      手記： プリンティングされたビオチン化ヒストンペプチドは、この方法で保存した場合、少なくとも6ヶ月間安定です。

2. マイクロアレイスライドの分割

1. 疎水性ワックスペン(図2C)
   1. ワックスペンを使用して、特徴を含む領域の周りにワックスを塗布します。ワックスを5分間風乾させてから、セクション3.
      に進みます 手記：ブロッキング後、アレイスポットを目視で視覚化するのが非常に困難になる場合があります。ArrayNinjaのスライドデザインは、縮尺に合わせて印刷し、ワックスを塗布するためのガイドとして使用できます。
2. シリコンガスケット(図2D)
   1. アレイガスケットの裏側から透明フィルムをはがし、接着剤面を下にしてマイクロアレイスライドに置きます。
   2. ガスケットを所定の位置に5秒間保持してから、セクション3に進みます。
3. ワックスインプリント(図2E)
   1. ワックスで仕切られるように設計されたスライドの場合は、10% BSA を使用してプレーンガラスにテストスライドを印刷します。このテストスライドを使用して、ワックスインプリンターガイドまたはアレイ設定を最適化し、すべての機能がワックスモールドチャンバー内にあることを確認します。
   2. マイクロアレイワックスインプリンターを85°Cに加熱し、すべてのワックスが完全に溶けるまで約30分間加熱します。
   3. 印刷面を下にしてスライドを挿入し、スライドをマイクロアレイインプリンタの右ガイドまで押し込みます。レバーを引き上げて、金型をスライドの表面に接触させます。2秒間保持します.
      手記： ホールドタイムは、最適なワックス境界の厚さを達成するために変更できます。
   4. スライドをすばやく取り外し、ワックスの境界線を目視検査して、すべてのウェルが密閉されていること、および境界線がスポットに侵入するほど厚くないことを確認します。スライドは湿気や光から保護する4°Cで保管してください.
      手記： ホールドタイムを増減して、境界を太くしたり細くしたりできます。

3. ヒストンPTM抗体とペプチドマイクロアレイのハイブリダイゼーション

1. ハイブリダイゼーションバッファー(PBS、pH 7.6、5% BSA、0.1% Tween-20)を調製します。
2. ハイブリダイゼーション容器を使用して、ハイブリダイゼーションバッファー内のスライドを平衡化します。スライド全体をハイブリダイゼーションバッファーで完全に覆い、オービタルシェーカーで4°Cで30分間低速でインキュベートします。
3. 希釈したヒストンPTM抗体をハイブリダイゼーションバッファーに含有する溶液を調製します.
   手記：サンプルデータでは、ヒストン抗体 #1 および抗体 #2 の両方をハイブリダイゼーションバッファーで 1:1,000 に希釈しました。イムノブロッティングに使用されるのと同様の希釈範囲を出発点として推奨します。
4. アレイを抗体溶液と1時間、4°Cでインキュベートし、抗体溶液を取り出し、アレイを4°Cで5分間3回洗浄し、冷PBS、pH 7.6
で洗浄します。
5. 蛍光色素標識二次抗体を1:5,000 - 1:10,000希釈してハイブリダイゼーションバッファーで調製します。
6. アレイを二次抗体溶液と4°Cで30分間インキュベートします。二次抗体溶液を取り出し、マイクロアレイスライドをPBS、pH 7.6で4°C、5分間3回洗浄します。0.1x PBS、pH 7.6の入った50 mLコニカルチューブにマイクロアレイを浸し、室温で余分な塩分を除去します。スライドをマイクロアレイスライド遠心分離機で室温で乾燥させます。
7. マイクロアレイスキャナーメーカーが推奨するスキャンプロトコルに従って、25μm以上の解像度のマイクロアレイスキャナーでスライドをスキャンします。
   手記： フルオレセイン標識ビオチントレーサーが存在する場合は、緑色のチャネル(例:488 nm、em:509 nm)と、蛍光色素標識二次抗体に対応するチャネル(通常は赤色(例:635 nm、em:677 nm))の両方をスキャンします。スキャンの目標は、1 つの .png ファイルにマージできる単一チャネルの .tif ファイルを取得することです。

図1:ArrayNinjaデザインモジュール。 ArrayNinja デザイン モジュールのスクリーン ショットは点線で示されています。コントロールパネル(上部)には、マイクロアレイプリンターで変更できるすべてのパラメーターが表示されます。これらのパラメータを調整すると、スライドレイアウトの漫画画像(左下)がリアルタイムで更新されます。レイアウトを設定した後、ユーザーは個々のスポットにマウスを合わせて、一意のフィーチャ識別子を入力できます。ArrayNinjaは、このユーザー入力から、指定されたマイクロアレイスライドレイアウトを作成するために必要なソースプレート(右下)の各フィーチャの位置のマップを構築します。

図2:マイクロアレイの作製。 (A)接触式マイクロアレイプリンターを用いたストレプトアビジン被覆顕微鏡スライド上のヒストンペプチドマイクロアレイ作製。(B)ペプチド特徴の48×48グリッドの3つのサブアレイで作製したマイクロアレイ。(C)疎水性ワックスペンによる3つのサブアレイ、(D)シリコン接着剤による2つのサブアレイ、および(E)ワックスインプリントによる48のサブアレイの分離。示されているすべてのマイクロアレイは、25 x 75 mmの顕微鏡スライドを使用して作製されています。

図3:ArrayNinja解析モジュール。ArrayNinja解析モジュールのスクリーンショットを示します。コントロールパネル(左上)には、配列を視覚化し、スポットを見つけ、配列画像上にグリッドを揃えるために調整できるすべてのパラメータが表示されます。フィーチャの上にマウスを置くと、拡大表示 (右上) と、そのフィーチャに関連付けられた識別情報を含むポップアップ (下) が表示されます。背景補正のために選択された参照スポットはオレンジ色です。下流解析から除外されるフィーチャは白です。ArrayNinja には、H4K16 の例に示すように、一致する特徴を黄色で強調表示するテキストベースの検索機能が含まれています。